Chick Heart Invasion Assay voor het testen van de Invasiviteit van kankercellen en de activiteit van potentieel anti-invasieve verbindingen
Summary
Hier presenteren we een protocol om de invasie van tumorcellen bestuderen in levende normaal weefsel fragmenten in drie dimensies. Dit orgelcultuur techniek wordt vooral toegepast om potentieel anti-invasieve drugs testen in vitro.
Abstract
Het doel van de kippehart assay is een relevant orgaan kweekmethode op tumorinvasie bestuderen bij drie dimensies bieden. De test kan onderscheid maken tussen invasieve en niet-invasieve cellen, en maakt onderzoek naar de effecten van testverbindingen op tumorinvasie. Kankercellen – hetzij als aggregaten of enkele cellen – geconfronteerd worden met fragmenten van embryonale kuiken hart. Na orgaankweek in suspensie gedurende een paar dagen of weken de tegenover cultures gefixeerd en ingebed in paraffine voor histologische analyse. Het driedimensionale interactie tussen kankercellen en normale weefsel wordt vervolgens gereconstrueerd uit opeenvolgende coupes gekleurd met hematoxyline-eosine of na immunohistochemische kleuring voor epitopen in het hartweefsel of de naar elkaar kankercellen. De assay is consistent met de recent concept dat kankerinvasie het gevolg van moleculaire interacties tussen kankercellen en hun naburige stromale ontvangende elementen (myofibroblasten, endothEliel cellen, extracellulaire matrix componenten, etc.). Hier wordt dit stromale omgeving aangeboden aan de kankercellen als levend weefsel fragment. Ondersteuning aspecten de relevantie van de assay zijn meerdere. Invasie in de test volgens de criteria van kankerinvasie: progressief bezetting en vervanging in tijd en ruimte van het gastheerweefsel en invasiviteit en niet-invasief in vivo van de tegenover cellen doorgaans correleert met de uitkomst van de assay. Bovendien is de invasie patroon van cellen in vivo, zoals bepaald door pathologen, blijkt uit de histologische beelden in de assay. Kwantitatieve structuur-activiteitsrelatie (QSAR) analyse van de met vele mogelijke anti-invasieve organische verbindingen congeneer resultaten kon de studie van structuur-activiteit relaties voor flavonoïden en chalconen en bekende anti-metastatische geneesmiddelen in de kliniek gebruikt (bijvoorbeeld, microtubule remmers ) remt invasie in de test ook. However, de assay geen rekening immunologisch bijdragen kankerinvasie.
Introduction
Invasion is het kenmerk van kwaadaardige tumoren. Deze activiteit leidt niet alleen tot de vernietiging van de omringende weefsels, maar is ook betrokken bij metastasevorming. Aangezien patiënten sterven aan kanker en metastase, en efficiënt anti-invasieve behandelingen zijn nog schaars, laboratoriumtesten die bootsen de invasie van tumorcellen ontwikkeld. Het doel van de kippehart assay is een relevant orgaan kweekmethode op tumorinvasie bestuderen bij drie dimensies bieden. De test kan onderscheid maken tussen invasieve en niet-invasieve cellen, en laat de effecten van testverbindingen op tumorinvasie te bestuderen.
De rationale achter het gebruik van de test is het idee dat tumoren ecosystemen waarbij de neoplastische cellen continu communiceren met hun stroma (gastheercellen en de extracellulaire matrix), en die door deze moleculaire interacties invasie verfijnd 1. Dus, in de assay tumorcellen worden geconfronteerd living embryonale kippehart 2 fragmenten, die niet alleen dienen als substraten voor invasie van de tumorcellen, maar ook als bron van verschillende bindweefselcellen en matrixelementen. De kippehart bevat myocyten, fibroblasten en endotheliale cellen en de extracellulaire matrix is samengesteld uit laminine, fibronectine en verschillende soorten collageen. Op deze manier wordt de driedimensionale orgaankweek techniek omvat vele cellulaire en moleculaire interacties betrokken zijn bij de invasie van tumoren van patiënten.
Het belangrijkste voordeel van het kippehart assay is de implementatie van stromale effecten. Dit aspect is vollediger dan in andere invasie in vitro assays die zijn gebaseerd op tumorcel invasie in niet-levende gels bestaande uit basaalmembraan 3 of 4 interstitiële matrix moleculen. Het concept van confrontatie tussen tumorcellen en normale leven gastheerweefsel zoals in orgaankweek experimenten werd door verscheidene ingevoerdauteurs waaronder Wolff en Schneider in Frankrijk 5, Easty en Easty in het Verenigd Koninkrijk 6 en Schleich in Duitsland 7. Twee technische voordelen van het kippehart invasie assay via genoemde werkwijzen is dat het volume van de fragmenten gemakkelijk gestandaardiseerd kan zijn, en dat deze documenten contractiele die functionele integriteit controle toelaat tijdens orgaankweek. Bovendien worden vogelembryo's de voorkeur, omdat zij gemakkelijk kunnen worden ontleed uit de steriele inhoud van het ei. De test moet conceptuele gelijkenis met het kuiken chorioallantois membraan assay 8 door het aanbieden van een complex stromale rondom de tumorcellen.
De test is met succes toegepast om onderscheid te maken tussen invasieve en niet-invasieve cellen varianten van dezelfde menselijke tumoren zoals in de MCF-7 (borstklier) 9 en HCT-8 (colon) 10 cellijn families. De techniek is nuttig om potentieel anti-invasieve testverbindingen en <sup> 11,12. Zoals verder uitgelegd, kan het worden gebruikt voor de vaststelling van structuur-activiteit relaties van kleine organische moleculen. De test maakt echter geen rekening gehouden met de bijdrage van immunologische cellen kankerinvasie. Er zij op gewezen dat de techniek niet kan worden beschouwd als een high-throughput analysesysteem, vanwege het grote aantal manipulaties, het beperkte aantal test runs (maximum 30 culturen) en de lange doorlooptijd (ongeveer 1 maand).
Protocol
Representative Results
Discussion
Tijdens de voorbereiding van PHF's, kunnen de fragmenten niet blijven in suspensie, maar houden aan de vaatwand; Dit kan worden ondervangen door het volume van het kweekmedium. Als het aantal PHFs is te laag en hun grootte is te groot, te verlagen van het volume van het kweekmedium. Falen van de testcellen om te aggregeren kan te wijten zijn aan schommelingen in de temperatuur of microbiële infectie. Als alternatief kan een onvermogen om te aggregeren een intrinsieke eigenschap van de cellen. Bij bevestiging van de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Marleen De Meulemeester for demonstrating the assay technique in the video film. B. I. R. is a Postdoctoral Research Fellow of the Research Foundation – Flanders (FWO – Vlaanderen). L.M.M. is a recipient of an Emmanuel van der Schueren grant from the Flemish League against Cancer (Vlaamse Liga tegen Kanker).
Materials
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
Riferimenti
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Van Roy, F. M., de Baetselier, P., JR, B. e. r. t. i. n. o. Molecular mechanisms of cancer invasion. Encyclopedia of Cancer. 2, 1072-1083 (1997).
- Mareel, M., Kint, J., Meyvisch, C. Methods of study of the invasion of malignant C3H mouse fibroblasts into embryonic chick heart in vitro. Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 30 (1), 95-111 (1979).
- Albini, A., Noonan, D. M. The ‘chemoinvasion’ assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- De Wever, O., et al. Single cell and spheroid collagen type I invasion assay. Methods Mol. Biol. 1070, 12-35 (2014).
- Wolff, E., Schneider, N. La transplantation prolongée d’un sarcome de souris sur des organes embryonnaires de poulet cultivés in vitro. C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 151 (7), 1291-1292 (1957).
- Easty, G. C., Easty, D. M. An organ culture system for the examination of tumor invasion. Nature. 199, 1104-1105 (1963).
- Schleich, A. B., Frick, M., Mayer, A. Patterns of invasive growth in vitro. Human decidua graviditatis confronted with established human cell lines and primary human explants. J. Natl. Cancer Inst. 56 (2), 221-237 (1976).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograftodel for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Bracke, M. E., Van Larebeke, N. A., Vyncke, B. M., Mareel, M. M. Retinoic acid modulates both invasion and plasma membrane ruffling of MCF-7 human mammary carcinoma cells in vitro. Br. J. Cancer. 63 (6), 867-872 (1991).
- Vermeulen, S. J., et al. Transition from the noninvasive to the invasive phenotype and loss of alpha-catenin in human colon cancer cells. Cancer Res. 55 (20), 4722-4728 (1995).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of 3,7-dimethoxyflavone in vitro. J. Pharma. Sci. 83 (9), 1217-1221 (1994).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of alkaloids and polyphenolics in vitro. Bioorg. Med. Chem. 5 (8), 1609-1619 (1997).
- Gaillard, P. J., MB, V. i. s. s. e. r. Organ culture technique using embryologic watch glasses. Methods in Medical Research. 2, 241-24 (1951).
- Romeis, B. Das mikrotom. Mikroskopische Technik. 15 Verb. Aufl. Kapitel. 7, 114-120 (1948).
- Van Marck, V., et al. P-cadherin promotes cell-cell adhesion and counteracts invasion in human melanoma. Cancer Res. 65 (19), 8774-8783 (2005).
- Attia, M. A., Weiss, D. W. Immunology of spontaneous mammary carcinomas in mice. V. Acquired tumor resistance and enhancement in strain A mice infected with mammary tumor virus. Cancer Res. 26 (8), 1787-1800 (1966).
- Katritzky, A. R., et al. QSAR modeling of anti-invasive activity of organic compounds using structural descriptors. Bioorg. Med. Chem. 14 (20), 6933-6939 (2006).
- McKinnell, R. G., Bruyneel, E. A., Mareel, M. M., Seppanen, E. D., Mekala, P. R. Invasion in vitro by explants of Lucke renal carcinoma cocultered with normal tissue is temperature dependent. Clin. Exp. Metastasis. 4 (4), 237-243 (1986).
- Wanson, J. C., de Ridder, L., Mosselmans, R. Invasion of hyperplastic nodule cells from diethylnitrosamine treated cells. Cancer Res. 41 (12 Pt 1), 5162-5175 (1981).
- Mareel, M. M., et al. Effect of temperature on invasion of MO4 mouse fibrosarcoma cells in organ culture. Clin. Exp. Metastasis. 2 (2), 107-125 (1984).
- Laerum, O. D., Steinsvag, S., Bjerkvig, R. Cell and tissue culture of the central nervous system: recent developments and current applications. Acta Neurol. Scand. 72 (6), 529-549 (1985).
- Schroyens, W., Mareel, M. M., Dragonetti, C. In vitro invasiveness of human bladder cancer from cell lines and biopsy specimens. Clin. Exp. Metastasis. 1 (2), 153-162 (1983).
- Mareel, M. M., De Bruyne, G. K., Vandesande, F., Dragonetti, C. Immunohistochemical study of embryonic chick heart invaded by malignant cells in three dimensional culture. Invasion Metastasis. 1 (3), 195-204 (1981).
- Bjerkvig, R., Laerum, O. D., Mella, O. Glioma cell interactions with fetal rat brain aggregates in vitro and with brain tissue in vivo. Cancer Res. 46 (8), 4071-4079 (1986).
- Bracke, M. E., et al. Confrontation of an invasive (MO4) and a non-invasive (MDCK) cell line with embryonic chick heart fragments in serum-free culture media. In Vitro Cell Dev. Biol. 22 (9), 508-514 (1986).
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Storme, G. A., Grundmann, E. Mechanisms of tumor spread: a brief overview. Cancer Campaign. 9: The Cancer Patient. , 59-64 (1985).
- De Neve, W. J., Storme, G. A., De Bruyne, G. K., Mareel, M. M. An image analysis system for the quantification of invasion in vitro. Clin. Exp. Metast. 3 (2), 87-101 (1985).
- Smolle, J., et al. Quantitative evaluation of melanoma cell invasion in three-dimensional confrontation cultures in vitro using automated image analysis. J. Invest. Dermatol. 94 (1), 114-119 (1990).
- Bracke, M. E., et al. flavonoid effect on tumor invasion and metastasis. Food Technol. 48 (11), 121-124 (1994).
- Bracke, M. E., et al. The influence of tangeretin on tamoxifen’s therapeutic benefit in mammary cancer. J. Natl. Cancer Inst. 91 (4), 354-359 (1999).
