テストのためのひよこ心臓浸潤アッセイ癌細胞の浸潤性および潜在的に抗浸潤化合物の活性
Summary
ここでは、三次元での正常組織片をリビングへの腫瘍細胞の浸潤を研究するためのプロトコルを提示します。この器官培養技術は、主にin vitroで 、潜在的に抗浸潤薬をテストするために適用されます。
Abstract
ニワトリ心臓アッセイの目的は、三次元で腫瘍浸潤を研究するための関連する器官培養方法を提供することです。アッセイは、侵襲的および非侵襲的な細胞とを区別し、腫瘍浸潤に対する試験化合物の効果の研究を可能にすることができます。癌細胞は – のいずれかの凝集体または単一細胞として – ニワトリ胚の心臓の断片に直面しています。数日または数週間のための懸濁液中の器官培養した後に直面している培養物を固定し、組織学的分析のためにパラフィンに包埋しました。癌細胞と正常組織との間の三次元相互作用は、その後、ヘマトキシリン – エオシンで、または心臓組織内のエピトープまたは対向癌細胞に対する免疫組織化学的染色後の染色連続切片から再構築されます。アッセイは、癌浸潤は、癌細胞とその隣接する間質ホスト要素（筋線維芽細胞、endoth間の分子間相互作用の結果であることを最近の概念と一致していますelial細胞、細胞外マトリックス成分、等）。ここで、この間質環境は、生体組織片などの癌細胞に提供されます。アッセイの妥当性への支援の側面が複数あります。時間と宿主組織の空間の漸進的占領と交換、および直面細胞の生体内での侵襲性および非侵襲性は、一般的に、アッセイの結果と相関する：アッセイにおける侵入は癌浸潤の基準に従うものです。さらに、 インビボでの細胞の浸潤パターンは、病理学者によって定義されるように、アッセイでの組織学的画像に反映されています。多数の潜在的抗浸潤有機同族化合物を用いて得られた結果の定量的構造活性関係（QSAR）分析は、診療所で使用されるフラボノイドおよびカルコン、および既知の抗転移薬のための構造-活性関係（ 例えば、微小管阻害剤の研究を可能にしました）ならびにアッセイに侵入を阻害します。 HoweveR、アッセイは、アカウントに癌浸潤に対する免疫学的貢献を取ることはありません。
Introduction
侵略は、悪性腫瘍の特徴です。この活動は、周囲の組織の破壊につながるだけでなく、転移形成に関与しているだけでなく。癌患者は、浸潤および転移によって死亡し、効率的な抗侵襲治療はまだ不足しているので、腫瘍細胞の浸潤を模倣する実験用アッセイが開発されています。ニワトリ心臓アッセイの目的は、三次元で腫瘍浸潤を研究するための関連する器官培養方法を提供することです。アッセイは、侵襲的および非侵襲的な細胞とを区別し、腫瘍浸潤に対する試験化合物の効果を研究することを可能にすることができます。
アッセイの使用の理論的根拠は、腫瘍は、腫瘍細胞が継続的に間質（宿主細胞と細胞外マトリックス）と相互作用し、かつ、これらの分子相互作用を介して侵入を微調整1である生態系であり、実際の概念です。そのため、アッセイにおいて腫瘍細胞をliviに直面しています腫瘍細胞による浸潤のための基質として、また間質細胞とマトリックス要素の異なるタイプの供給源として働くだけでなく、ngのニワトリ胚の心臓断片2、。ニワトリの心臓は、筋細胞、線維芽細胞および内皮細胞を含む、細胞外マトリックスはラミニン、フィブロネクチンおよびコラーゲンの異なる種類で構成されています。このように、三次元器官培養技術は、患者の腫瘍の浸潤に関与する多くの細胞および分子間相互作用を覆います。
ニワトリの心臓アッセイの主な利点は、間質効果の実装です。この局面は、基底膜3または間質マトリックス4分子からなる非生物ゲルに腫瘍細胞の浸潤に基づいて、in vitroで他の浸潤アッセイよりも完全です。器官培養実験に見られるように、腫瘍細胞と正常な生体宿主組織との間の対立の概念は、いくつかによって導入されましたイギリス6、およびドイツ7のシュライヒでウルフとシュナイダーフランス5で、イースティとイースティ含む作者。引用された方法に比べて、ニワトリの心臓浸潤アッセイの二つの技術的利点は、フラグメントの量を簡単に標準化することができること、およびそれらが器官培養中に機能の完全性の監視を可能に収縮、残っていることです。それらは容易に卵の無菌内容から切除することができるのでさらに、鳥類の胚が好ましいです。アッセイは、腫瘍細胞に周囲の複雑な間質を提供することにより、ニワトリ漿尿膜の膜アッセイ8に概念的な類似性を有しています。
アッセイは、正常にかかる9およびHCT-8（大腸）10細胞株ファミリーMCF-7（乳房）と同様のヒト腫瘍の浸潤性および非浸潤性細胞の変異体を区別するために適用されています。技術は、同様に、潜在的に抗浸潤化合物を試験するのに有用です<suP> 11,12。さらに説明されるように、それは小有機分子の構造 – 活性関係を確立するために使用することができます。アッセイは、しかし、アカウントに癌浸潤に対する免疫学的細胞の寄与を取ることはありません。それは技術があるため操作の数が多い、検定実行の限られた数（最大30文化）と長いターンアラウンドタイム（約1ヶ月）の、ハイスループット分析システムとみなすことはできないことを強調すべきです。
Protocol
Representative Results
Discussion
たPHFの準備中に、断片は懸濁液中に滞在しないかもしれないが、血管壁に付着します。これは、培養培地の体積を増加させることによって克服することができます。たPHFの数が少なすぎるとそのサイズが大きすぎる場合には、培地の容積を減少させます。集約する試験細胞の障害は、温度または微生物感染に対する変動に起因する可能性があります。あるいは、集約することができないこと?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Marleen De Meulemeester for demonstrating the assay technique in the video film. B. I. R. is a Postdoctoral Research Fellow of the Research Foundation – Flanders (FWO – Vlaanderen). L.M.M. is a recipient of an Emmanuel van der Schueren grant from the Flemish League against Cancer (Vlaamse Liga tegen Kanker).
Materials
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
Riferimenti
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