Chick Hjerte Invasion analyse for Teste Invasivitet av kreftceller og aktiviteten til Potensielt Anti-invasive Forbindelser

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å studere invasjon av tumorceller til normale levende vev fragmenter i tre dimensjoner. Dette organet kultur teknikken er i hovedsak brukt til å teste potensielt anti-invasive medikamenter in vitro.

Abstract

Målet med dama hjertet analysen er å tilby en relevant organ kultur metode for å studere tumorinvasjon i tre dimensjoner. Analysen kan skille mellom invasive og ikke-invasive celler, og muliggjør studium av effekten av testforbindelser på tumorinvasjon. Kreftceller – enten som tilslag eller enkeltceller – blir konfrontert med fragmenter av embryonale chick hjerte. Etter organkultur i suspensjon i noen dager eller uker de motstå kulturene fiksert og innstøpt i parafin for histologisk analyse. Den tredimensjonale interaksjon mellom kreftceller og normale vev blir så rekonstruert fra seriesnitt farget med hematoksylin-eosin eller etter immunohistokjemisk farging for epitoper i hjertevevet, eller de motstående kreftceller. Analysen er i overensstemmelse med den siste konsept som kreft invasjon er et resultat av molekylære interaksjoner mellom kreftceller og deres nabo stromale vertselementer (myofibroblasts, endothelial celler, ekstracellulære matrisekomponenter, etc.). Her er denne stromal miljøet tilbudt kreftcellene som et levende vev fragment. Støtte aspekter til relevansen av analysen er flere. Invasjon i analysen er i overensstemmelse med kriteriene for kreft invasjon: progressiv yrke og utskifting i tid og rom i vertsvevet, og invasivitet og ikke-invasivitet in vivo av de motstående celler korrelerer generelt med resultatet av analysen. Videre invasjonen mønsteret av celler in vivo, som definert av patologer, gjenspeiles i de histologiske bildene i analysen. Kvantitativ struktur-aktivitet-forhold (QSAR) analyse av resultatene oppnådd med en rekke potensielt anti-invasive kongener organiske forbindelser som tillot undersøkelse av struktur-aktivitetsrelasjoner for flavonoider og chalconer, og kjente anti-metastatiske midler som anvendes i klinikken (f.eks mikrotubul-inhibitorer ) hemmer invasjon i analysen også. However, ikke analysen tar ikke hensyn til immunologiske bidrag til kreft invasjon.

Introduction

Invasion er kjennetegnet av ondartede svulster. Denne aktiviteten ikke bare fører til ødeleggelse av omkringliggende vev, men er også implisert i metastasedannelse. Siden kreftpasienter dør av invasjon og metastase, og effektive anti-invasiv behandling er fremdeles sjeldne, laboratorieanalyser som etterligner invasjon av tumorceller har blitt utviklet. Målet med dama hjertet analysen er å tilby en relevant organ kultur metode for å studere tumorinvasjon i tre dimensjoner. Analysen kan skille mellom invasive og ikke-invasive celler, og gjør det mulig å studere effektene av testforbindelser på tumorinvasjon.

Begrunnelsen for bruk av analysen er selve konseptet at svulster er økosystemer der de neoplastiske cellene kontinuerlig samhandler med sine stroma (vertsceller og ekstracellulære matrise), og at vi gjennom disse molekylære interaksjoner invasjon er finjustert ^1. Så, i analysen tumorceller blir konfrontert med Living embryoniske kylling hjerte fragmenter ^2, som tjener ikke bare som substrater for invasjon av tumorceller, men også som en kilde til forskjellige typer av stromale celler og matriseelementer. Dama hjerte inneholder muskelceller, fibroblaster og endotelceller, og den ekstracellulære matriks består av laminin, fibronektin og forskjellige typer av kollagen. På denne måten, omfatter den tredimensjonale organkultur teknikk mange cellulære og molekylære interaksjoner involvert i invasjon av pasient tumorer.

Den største fordelen med dama hjertet analysen er implementeringen av stromale effekter. Dette aspektet er mer fullstendig enn i andre invasjons analyser in vitro som er basert på tumorcelle-invasjon i ikke-levende geler som består av basalmembran ³ eller interstitial matrise ⁴ molekyler. Begrepet konfrontasjon mellom tumorceller og normale vertsvev løsning som finnes i organkultur eksperimenter er blitt introdusert av flereForfatterne inkludert Wolff og Schneider i Frankrike ^5, easty og easty i Storbritannia ⁶ og Schleich i Tyskland ^7. To tekniske fordeler ved brud hjerte invasjonen assay de siterte fremgangsmåter er at volumet av fragmentene lett kan standardiseres, og at de forblir kontraktile, som tillater funksjonell integritet overvåking under organkultur. Videre er avian embryo foretrukket, fordi de lett kan dissekert fra det sterile innhold av egg. Analysen har konseptuelle likhet med den dama chorioallantois membranen assay ⁸ ved å tilby et kompleks stromal omgir til tumorcellene.

Analysen har med hell vært anvendt for å skille mellom invasive og ikke-invasive cellevariantene fra de samme humane tumorer slik som i MCF-7 (bryst-) ⁹ og HCT-8 (kolon) ¹⁰ cellelinje familier. Den teknikken er nyttig for å teste potensielle anti-invasive forbindelser, så vel <sup> 11,12. Som videre forklart, kan den brukes for opprettelse av struktur-aktivitetsrelasjoner av små organiske molekyler. Analysen gjør imidlertid ikke ta hensyn til bidraget fra immunologiske celler til kreft invasjon. Det bør understrekes at teknikken ikke kan anses som et high-throughput analysesystem, på grunn av det høye antallet manipulasjoner, begrenset antall analyser, (maksimalt 30 kulturer) og den lange turn-around tid (ca. 1 måned).

Protocol

Figur 1. Skjematisk oversikt over de ulike analysetrinnene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 1. Utarbeidelse av-dyrket Hjerte Fragments (PHFs) Inkuber et befruktet chick egg ved 37 ° C i 9 dager. Fylles inkubasjon av en dato som gjør at påf…

Representative Results

De histologiske snitt som vist i figur 5 viser sluttresultatet av en rekke vellykkede tester. Lyden histologi av kulturene viser levedyktige celler og gjør det mulig å tolke interaksjonen mellom tumorceller og normale vev. Videre kan noen immunreaksjon fra normalt vev holdes, noe som bekrefter den korrekte alderen på kyllingfoster brukes f.eks, før immunavstøtning Systemet er utviklet. Det er ingen bakterier synlige, noe som indikerer fravær av (brutto) forurensning under kultur perioden. Endelig er den a…

Discussion

Under utarbeidelsen av PHFs, kan fragmentene ikke bo i suspensjon, men holder seg til åreveggen; Dette kan overvinnes ved å øke volumet av kulturmediet. Hvis antallet PHFs er for lav, og deres størrelse er for stor, redusere volumet av kulturmediet. Svikt i testcellene til å aggregere kan skyldes variasjoner i temperatur eller for mikrobiell infeksjon. Alternativt kan en manglende evne til å aggregere være en iboende karakteristikk av cellene. Ved festing av aggregatene til PHF, kan dårlig adhesjon overvinnes ve…

Materials

Ringer's salt solution	Braun	CEO123
Bacto-agar	Becton Dickinson	214010
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar	VWR	103157P
BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract.	Sigma	A4503-500G
MEM-Rega 3	Life Technologies	19993013
Gyrotory shakers	New Brunswick Scientific	G10 and G33
Erlenmeyer flasks 50 ml	Novolab	92717
Glass Petri dishes	Novolab	68516
Iridectomy scissors	Rumex	11-0625
Macroscope with calibrated ocular grid	Wild	157702
Paraffin wax	International Medical products	8599956
Eosin Y	Sigma	230251-25g
Harris' hematoxylin	Sigma	HHS32-1L
Coverslipping resin (Tissue-Tek)	Sakura	4494
Paraffin melting apparatus	GFL	1052
Microtome for paraffin sectioning	Reichert
Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets	Novolab	2602421 and 260243
Diaminobenzidine	Sigma	D8001
REAX rocking table	Heidolph	54131
24-well tissue dishes	VWR	NUNC142475
Ophtalmological enucleation spoon	Rumex	16-060
Sharp forceps	Rumex	4-111T
Blunt forceps	Nickel-Electro LTD	7112
Erlenmeyer flasks 5 ml	Novolab	211901
Microscope slides washed and degreased	International Medical products	8613908