Ensayo Invasión polluelo corazón para probar la invasividad de las células del cáncer y de la actividad de los compuestos potencialmente anti-invasivos
Summary
A continuación, presentamos un protocolo para estudiar la invasión de las células tumorales en fragmentos de tejido normal que vive en tres dimensiones. Esta técnica de cultivo de órganos se aplica principalmente para probar fármacos potencialmente anti-invasivos in vitro.
Abstract
El objetivo del ensayo de corazón de pollo es ofrecer un método de cultivo de órganos relevante para estudiar la invasión tumoral en tres dimensiones. El ensayo puede distinguir entre células invasivas y no invasivas, y permite el estudio de los efectos de los compuestos de ensayo sobre la invasión tumoral. Las células cancerosas – ya sea en forma de agregados o células individuales – se enfrentan a fragmentos de corazón de embriones de pollo. Después de cultivo de órganos en suspensión durante unos pocos días o semanas los cultivos que se enfrenta son fijos y embebidos en parafina para análisis histológico. La interacción tridimensional entre las células cancerosas y el tejido normal es entonces reconstruida a partir de secciones en serie teñidas con hematoxilina-eosina o después de la tinción inmunohistoquímica para epítopos en el tejido del corazón o las células cancerosas que se enfrentan. El ensayo es consistente con el concepto reciente que la invasión del cáncer es el resultado de interacciones moleculares entre las células cancerosas y sus elementos de acogida del estroma vecina (miofibroblastos, endothElial células, componentes de la matriz extracelular, etc.). Aquí, este entorno estromal se ofrece a las células del cáncer como un fragmento de tejido vivo. Apoyo a los aspectos a la pertinencia del ensayo son múltiples. Invasión en el ensayo es de acuerdo con los criterios de la invasión del cáncer: ocupación progresiva y servicios de sustitución en el tiempo y el espacio del tejido del huésped, y la invasividad y no invasividad in vivo de las células que se enfrentan generalmente se correlaciona con el resultado del ensayo. Además, el patrón de invasión de las células in vivo, tal como se define por los patólogos, se refleja en las imágenes histológicas en el ensayo. Cuantitativa relación estructura-actividad (QSAR) el análisis de los resultados obtenidos con numerosos compuestos congéneres orgánicos potencialmente anti-invasivos permitió el estudio de las relaciones estructura-actividad de los flavonoides y chalconas y medicamentos anti-metastásicos conocidos utilizados en la clínica (por ejemplo, inhibidores de microtúbulos ) inhibir la invasión en el ensayo como bien. However, el ensayo no tiene en cuenta las contribuciones inmunológicas a la invasión del cáncer.
Introduction
Invasion es el sello de tumores malignos. Esta actividad no sólo lleva a la destrucción de los tejidos circundantes, pero también está implicada en la formación de metástasis. Dado que los pacientes de cáncer mueren a causa de la invasión y la metástasis, y tratamientos anti-invasivos eficientes son todavía escasos, ensayos de laboratorio que imitan la invasión de las células tumorales se han desarrollado. El objetivo del ensayo de corazón de pollo es ofrecer un método de cultivo de órganos relevante para estudiar la invasión tumoral en tres dimensiones. El ensayo puede distinguir entre células invasivas y no invasivas, y permite estudiar los efectos de los compuestos de ensayo sobre la invasión tumoral.
La razón detrás de la utilización del ensayo es el concepto actual de que los tumores son ecosistemas donde las células neoplásicas interactúan continuamente con su estroma (células huésped y la matriz extracelular), y que a través de estas interacciones invasión molecular es afinado 1. Así, en el ensayo de células tumorales se enfrentan a Livifragmentos ng embrionarias corazón polluelo 2, que sirven no sólo como sustratos para la invasión por las células tumorales, sino también como una fuente de diferentes tipos de células del estroma y elementos de la matriz. El corazón de pollo contiene miocitos, fibroblastos y células endoteliales, y la matriz extracelular se compone de laminina, fibronectina y diferentes tipos de colágeno. De esta manera, la técnica de cultivo de órganos tridimensional cubre muchas interacciones celulares y moleculares implicados en la invasión de los tumores de los pacientes.
La principal ventaja del ensayo de corazón de pollo es la implementación de los efectos del estroma. Este aspecto es más completa que en otros ensayos de invasión in vitro que se basan en invasión de células tumorales en geles no vivos compuestas de membrana basal o matriz intersticial 3 4 moléculas. El concepto de la confrontación entre las células tumorales y tejidos normales huésped vivo como se encuentra en cultivo de órganos experimentación se ha introducido por variosautores como Wolff y Schneider en Francia 5, Easty y Easty en el Reino Unido el 6 y 7 Schleich en Alemania. Dos ventajas técnicas de la invasión de ensayo corazón polluelo en los métodos citados es que el volumen de los fragmentos puede ser fácilmente estandarizada, y que permanecerá contráctil, que permite la monitorización integridad funcional durante el cultivo de órganos. Además, se prefieren los embriones de aves, ya que fácilmente pueden ser diseccionados desde el contenido estéril del huevo. El ensayo tiene semejanza conceptual para el ensayo de membrana corioalantoidea de pollo 8 ofreciendo un complejo del estroma que rodea a las células tumorales.
El ensayo se ha aplicado con éxito para distinguir entre variantes de células invasivas y no invasivas de los mismos tumores humanos, tales como en el MCF-7 (mamaria) 9 y HCT-8 (colon) 10 familias línea celular. La técnica es útil para ensayar compuestos potencialmente anti-invasivos, así <sup> 11,12. Como se explica más, que puede ser utilizado para el establecimiento de las relaciones estructura-actividad de pequeñas moléculas orgánicas. El ensayo, sin embargo, no toma en cuenta la contribución de las células inmunológicas de la invasión del cáncer. Cabe destacar que la técnica no puede considerarse como un sistema de análisis de alto rendimiento, debido al alto número de manipulaciones, el número limitado de pistas de ensayo (máximo 30 culturas) y el largo tiempo de vuelco (alrededor de 1 mes).
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la preparación de PHFs, los fragmentos no pueden permanecer en suspensión, pero se adhieren a la pared del vaso; esto se puede superar mediante el aumento del volumen del medio de cultivo. Si el número de PHFs es demasiado bajo y su tamaño es demasiado grande, disminuir el volumen del medio de cultivo. El fallo de las células de ensayo a agregarse puede ser debido a las fluctuaciones en la temperatura o a la infección microbiana. Alternativamente, una incapacidad para agregado puede ser una característica…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Marleen De Meulemeester for demonstrating the assay technique in the video film. B. I. R. is a Postdoctoral Research Fellow of the Research Foundation – Flanders (FWO – Vlaanderen). L.M.M. is a recipient of an Emmanuel van der Schueren grant from the Flemish League against Cancer (Vlaamse Liga tegen Kanker).
Materials
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
Riferimenti
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Van Roy, F. M., de Baetselier, P., JR, B. e. r. t. i. n. o. Molecular mechanisms of cancer invasion. Encyclopedia of Cancer. 2, 1072-1083 (1997).
- Mareel, M., Kint, J., Meyvisch, C. Methods of study of the invasion of malignant C3H mouse fibroblasts into embryonic chick heart in vitro. Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 30 (1), 95-111 (1979).
- Albini, A., Noonan, D. M. The ‘chemoinvasion’ assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- De Wever, O., et al. Single cell and spheroid collagen type I invasion assay. Methods Mol. Biol. 1070, 12-35 (2014).
- Wolff, E., Schneider, N. La transplantation prolongée d’un sarcome de souris sur des organes embryonnaires de poulet cultivés in vitro. C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 151 (7), 1291-1292 (1957).
- Easty, G. C., Easty, D. M. An organ culture system for the examination of tumor invasion. Nature. 199, 1104-1105 (1963).
- Schleich, A. B., Frick, M., Mayer, A. Patterns of invasive growth in vitro. Human decidua graviditatis confronted with established human cell lines and primary human explants. J. Natl. Cancer Inst. 56 (2), 221-237 (1976).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograftodel for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Bracke, M. E., Van Larebeke, N. A., Vyncke, B. M., Mareel, M. M. Retinoic acid modulates both invasion and plasma membrane ruffling of MCF-7 human mammary carcinoma cells in vitro. Br. J. Cancer. 63 (6), 867-872 (1991).
- Vermeulen, S. J., et al. Transition from the noninvasive to the invasive phenotype and loss of alpha-catenin in human colon cancer cells. Cancer Res. 55 (20), 4722-4728 (1995).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of 3,7-dimethoxyflavone in vitro. J. Pharma. Sci. 83 (9), 1217-1221 (1994).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of alkaloids and polyphenolics in vitro. Bioorg. Med. Chem. 5 (8), 1609-1619 (1997).
- Gaillard, P. J., MB, V. i. s. s. e. r. Organ culture technique using embryologic watch glasses. Methods in Medical Research. 2, 241-24 (1951).
- Romeis, B. Das mikrotom. Mikroskopische Technik. 15 Verb. Aufl. Kapitel. 7, 114-120 (1948).
- Van Marck, V., et al. P-cadherin promotes cell-cell adhesion and counteracts invasion in human melanoma. Cancer Res. 65 (19), 8774-8783 (2005).
- Attia, M. A., Weiss, D. W. Immunology of spontaneous mammary carcinomas in mice. V. Acquired tumor resistance and enhancement in strain A mice infected with mammary tumor virus. Cancer Res. 26 (8), 1787-1800 (1966).
- Katritzky, A. R., et al. QSAR modeling of anti-invasive activity of organic compounds using structural descriptors. Bioorg. Med. Chem. 14 (20), 6933-6939 (2006).
- McKinnell, R. G., Bruyneel, E. A., Mareel, M. M., Seppanen, E. D., Mekala, P. R. Invasion in vitro by explants of Lucke renal carcinoma cocultered with normal tissue is temperature dependent. Clin. Exp. Metastasis. 4 (4), 237-243 (1986).
- Wanson, J. C., de Ridder, L., Mosselmans, R. Invasion of hyperplastic nodule cells from diethylnitrosamine treated cells. Cancer Res. 41 (12 Pt 1), 5162-5175 (1981).
- Mareel, M. M., et al. Effect of temperature on invasion of MO4 mouse fibrosarcoma cells in organ culture. Clin. Exp. Metastasis. 2 (2), 107-125 (1984).
- Laerum, O. D., Steinsvag, S., Bjerkvig, R. Cell and tissue culture of the central nervous system: recent developments and current applications. Acta Neurol. Scand. 72 (6), 529-549 (1985).
- Schroyens, W., Mareel, M. M., Dragonetti, C. In vitro invasiveness of human bladder cancer from cell lines and biopsy specimens. Clin. Exp. Metastasis. 1 (2), 153-162 (1983).
- Mareel, M. M., De Bruyne, G. K., Vandesande, F., Dragonetti, C. Immunohistochemical study of embryonic chick heart invaded by malignant cells in three dimensional culture. Invasion Metastasis. 1 (3), 195-204 (1981).
- Bjerkvig, R., Laerum, O. D., Mella, O. Glioma cell interactions with fetal rat brain aggregates in vitro and with brain tissue in vivo. Cancer Res. 46 (8), 4071-4079 (1986).
- Bracke, M. E., et al. Confrontation of an invasive (MO4) and a non-invasive (MDCK) cell line with embryonic chick heart fragments in serum-free culture media. In Vitro Cell Dev. Biol. 22 (9), 508-514 (1986).
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Storme, G. A., Grundmann, E. Mechanisms of tumor spread: a brief overview. Cancer Campaign. 9: The Cancer Patient. , 59-64 (1985).
- De Neve, W. J., Storme, G. A., De Bruyne, G. K., Mareel, M. M. An image analysis system for the quantification of invasion in vitro. Clin. Exp. Metast. 3 (2), 87-101 (1985).
- Smolle, J., et al. Quantitative evaluation of melanoma cell invasion in three-dimensional confrontation cultures in vitro using automated image analysis. J. Invest. Dermatol. 94 (1), 114-119 (1990).
- Bracke, M. E., et al. flavonoid effect on tumor invasion and metastasis. Food Technol. 48 (11), 121-124 (1994).
- Bracke, M. E., et al. The influence of tangeretin on tamoxifen’s therapeutic benefit in mammary cancer. J. Natl. Cancer Inst. 91 (4), 354-359 (1999).
