Роза Бенгалия фототромбоза конфокальной оптической томографии<em> В Vivo</em>: Модель одно судно инсульта
Summary
Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.
Abstract
In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.
Introduction
Техника, описанная разрешений визуализация в естественных условиях клеточных реакций сразу же после индукции бенгалроза фототромбоза в неповрежденной мыши. Бенгальский розовый (4,5,6,7-тетрахлор-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) является светочувствительный краситель используется, чтобы вызвать ишемический инсульт в моделях на животных (мыши и крысы). После болюсного введения РБ через хвостовую вену и последующего освещения через разбавлять черепа с 564 нм лазерного света, тромб индукционных вызывая физиологическую инсульт 1. Метод был впервые описан Розенблюм и Эль-Саббан в 1977 году, а позже была адаптирована Уотсон в середине 1980-х годов 1,2. Вкратце, бенгальский розовый облучении зеленым светом возбуждения (561 нм лазера в нашем случае), который генерирует выработку активных форм кислорода, которые впоследствии активирует тканевой фактор, инициатор каскада свертывания крови. Индукция каскада коагуляции производит ишемическая леион, патологически отношение к клинической инсульта 3.
Ход имеет сложную патофизиологию из-за взаимодействия многих типов различных клеток, включая нейроны, глии, эндотелия и иммунной системы. Выбор лучшую технику для изучения частности клеточный процесс требует нескольких соображений. Экспериментальные методы можно в целом разделить на три категории: в пробирке, в естественных условиях и в кремнии с каждой имеющих преимущества и недостатки В пробирке исследования имеют основной недостаток удаления клеток из их естественной среды и, следовательно, не может воспроизвести эффекты, наблюдаемые в неприкосновенности,. живого животного. IN VIVO методы обеспечивают для повышения экспериментальной репликации болезненных состояний с повышенной поступательного значение. В силиконового обычно относится к компьютерному моделированию заболевания или клеточных процессов, и в то время больше используются для изучения потенциальных лекарственных взаимодействий для экзаменаPLE, любая информация, почерпнутые еще должна быть проверена в живых клетках или ткани.
Идеальная модель инсульта в лабораторных условиях должны продемонстрировать аналогичные патологические особенности тем, которые видели в человеческой популяции. В то время как существуют общие физиологические характеристики инсульта в популяции человека, есть также много различий в зависимости от типа травмы испытывал. Инсульт в человеческой популяции происходит в малых или больших окклюзии сосудов, геморрагические поражения и артерии к артерии или сердечно-эмболии, которые приводят к различным объем инфаркта, а также различия в механизмах, связанных с каждой патологии. Преимущество использования модели инсульта животное генерация воспроизводимых инфарктов, которые имитируют характеристики человеческой инсульта. Наиболее распространенные модели на животных инсульта включают окклюзии артерии с помощью: окклюзия средней мозговой артерии (эмболия или эндоваскулярные методы накаливания), какие модели дистального МСАО и модель фототромбоза. ПреимуществаD недостатки каждой модели были рассмотрены в другом месте (см 4 и 5). Глобальные ишемические модели (MCAO), в то время как относительно легко выполнить которые менее отношение к человеческой инсульта, чем координационные модели инсульта. Кроме того, эти методы сильно варьируют в индукции воспроизводимых поражений инфаркт мозга. Фототромбоза модель высокой воспроизводимостью тех пор, пока экспериментатор контролирует их эксперименты также, обеспечивая четкое преимущество над моделей MCAO. Тем не менее, из-за микрососудов оскорбление модель была описана для отображения минимального ишемической полутени, область, где клетки, как полагают, спасти, 6,7. Кроме того, Вазогенный отек и образование отека цитотоксических также может быть вызвана при облучении области изображения. Несмотря на эти ограничения техника обеспечила новый взгляд на многие физиологические процессы следующих инсульта 8, 9, 10, 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Возможность перевести экспериментальный хода патофизиологии от животного к человеку заявка была сталкивается с неудачей. Тем не менее, использование моделей животных, таких как модели фототромбоза, позволяет улучшить понимание хода патофизиологии и исследование новых терапевтичес?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for this work was provided by: AG007218 and NIH F32 AG031606.
Images were generated in the Core Optical Imaging Facility, which is supported by UTHSCSA, NIH-NCI P30 CA54174 (CTRC at UTHSCSA) and NIH-NIA P01AG19316.
Materials
| Reagents | |||
| Rose Bengal | Sigma | 330000 | |
| Isoflurane Anesthetic | MWI Veterinary Supply | 088-076 | |
| Vetbond | 1469SB | 1469SB | |
| aCSF | 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4). | ||
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Dissecting Scissors | Bioindustrial Products | 500-410 | |
| Operating scissors 14 cm | Bioindustrial Products | 12-055 | |
| Forceps Dumont High Tech #5 style, straight | Bioindustrial Products | TWZ-301.22 | |
| LabJack 132X80 | Optosigma Co | 123-6670 | |
| Platform for Labjack 8X 8 | Optosigma Co | 145-1110 | |
| Ear bar holder from stereotaxic setup | Stoelting/Cyborg | 51654 | |
| Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine | DRE, Inc. | 15001 | |
| Tech IV Isoflurane vaporizer | DRE, Inc. | 34001 | |
| F Air Canister | DRE, Inc | 80120 | |
| Bain circuit breathing tube | DRE, Inc | 86111B | |
| Rodent adapter for bain tube | DRE, Inc | 891000 | |
| O2 regulator for oxygen tanks | DRE, Inc | CE001E | |
| Rodent induction chamber | DRE, Inc | 15004C | |
| Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle | Suture Express | 1639G | |
| Objective inverter Optical Adapter | LSM technologies | ||
| Foredom drill Dual voltage 110/120 | Foredom | 134.53 |
Riferimenti
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17, 497-504 (1985).
- Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40, 320-328 (1977).
- Owens, A. P., Mackman, N. Sources of tissue factor that contribute to thrombosis after rupture of an atherosclerotic plaque. Thrombosis Research. 129, S30-S33 (2012).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2, 396-409 (2005).
- . . Manual of stroke models in rats. , (2009).
- Herz, R. C., Kasbergen, C. M., Hillen, B., Versteeg, D. H., de Wildt, D. J. Rat middle cerebral artery occlusion by an intraluminal thread compromises collateral blood flow. Brain Research. 791, 223-228 (1998).
- Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism : Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 8, 474-485 (1988).
- Zheng, W., et al. Purinergic receptor stimulation reduces cytotoxic edema and brain infarcts in mouse induced by photothrombosis by energizing glial mitochondria. PloS One. 5, e14401 (2010).
- Zheng, D. M., Wewer, J., Lechleiter, J. P. 2. Y. 1. R. -. i. n. i. t. i. a. t. e. d. IP3R-dependent stimulation of astrocyte mitochondrial metabolism reduces and partially reverses ischemic neuronal damage in mouse. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 600-611 (2013).
- Witte, O. W., Stoll, G. Delayed and remote effects of focal cortical infarctions: secondary damage and reactive plasticity. Advances in Neurology. 73, 207-227 (1997).
- Hagemann, G., Redecker, C., Neumann-Haefelin, T., Freund, H. J., Witte, O. W. Increased long-term potentiation in the surround of experimentally induced focal cortical infarction. Annals of Neurology. 44, 255-258 (1998).
- Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
- Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 12670-12675 (2010).
- Nishimura, N., Rosidi, N. L., Iadecola, C., Schaffer, C. B. Limitations of collateral flow after occlusion of a single cortical penetrating arteriole. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30, 1914-1927 (2010).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 365 (2007).
- Blum, S., et al. Memory after silent stroke: Hippocampus and infarcts both matter. Neurology. 78, 38-46 (2012).
- Heinsius, T., Bogousslavsky, J., Van Melle, G. Large infarcts in the middle cerebral artery territory Etiology and outcome patterns. Neurology. 50, 341-350 (1998).
- Wardlaw, J. What causes lacunar stroke. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 76, 617-619 (2005).
- Inoue, Y., et al. Ischemic stroke under anticoagulant therapy]. Rinsho shinkeigaku. Clinical Neurology. 50, 455-460 (2010).
- Tiannan Wang, W. C., Xie, Y., Zhang, W., Ding, S. Controlling the Volume of the Focal Cerebral Ischemic Lesion through Photothrombosis. American Journal of Biomedical Sciences. 2, 33-42 (2009).
- Head, B. P., Patel, P. Anesthetics and brain protection. Current Opinion in Anaesthesiology. 20, 395-399 (2007).
- Kirsch, J. R., Traystman, R. J., Hurn, P. D. Anesthetics and cerebroprotection: experimental aspects. International Anesthesiology Clinics. 34, 73-93 (1996).
- Koerner, I. P., Brambrink, A. M. Brain protection by anesthetic agents. Current Opinion in Anaesthesiology. 19, 481-486 (2006).
- Gelb, A. W., Bayona, N. A., Wilson, J. X., Cechetto, D. F. Propofol anesthesia compared to awake reduces infarct size in rats. Anesthesiology. 96, 1183-1190 (2002).
- Bhardwaj, A., Castro, I. A., Alkayed, N. J., Hurn, P. D., Kirsch, J. R. Anesthetic choice of halothane versus propofol: impact on experimental perioperative stroke. Stroke; A Journal Of Cerebral Circulation. 32, 1920-1925 (2001).
- Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6, 511-512 (2009).
