روز البنغال Photothrombosis بواسطة التصوير الضوئي متحد البؤر<em> في فيفو</em>: نموذج لسفينة واحدة السكتة الدماغية
Summary
Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.
Abstract
In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.
Introduction
تقنية الموضحة تصاريح التصور في الجسم الحي الاستجابات الخلوية التالية تحريض روز البنغال على الفور photothrombosis في الماوس سليمة. روز البنغال (4،5،6،7-tetrachloro-2، 4، 5، 7'-tetraiodofluorescein) هو صبغ حساس يستخدم للحث على السكتة الدماغية في النماذج الحيوانية (الماوس والفئران). بعد حقن البلعة من RB عن طريق الوريد الذيل وإضاءة لاحقة من خلال الجمجمة ضعيفة مع ضوء الليزر 564 نانومتر، الجلطة هو فعل يسبب السكتة الدماغية الفسيولوجية 1. طريقة وصفت في الأصل من قبل روزنبلوم وايل الصبان في عام 1977، وتكييفها في وقت لاحق من قبل واتسون في منتصف 1980s 1،2. وباختصار، فإن المشع روز البنغال مع الضوء الأخضر الإثارة (ليزر 561 نانومتر في حالتنا)، الذي يولد إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية، والذي ينشط في وقت لاحق العامل النسيجي، وهو البادئ شلال التخثر. تحريض شلال التخثر ينتج الدماغية ليهأيون التي هي ذات الصلة مرضي السكتة الدماغية السريرية 3.
السكتة الدماغية لديها الفيزيولوجيا المرضية المعقدة ويرجع ذلك إلى تفاعل العديد من خلايا مختلفة الأنواع بما في ذلك الخلايا العصبية، الدبقية، البطانة والجهاز المناعي. اختيار أفضل أسلوب لدراسة تتطلب عملية الخلوية معينة اعتبارات متعددة. تقنيات تجريبية تقع على نطاق واسع في واحدة من ثلاث فئات: في المختبر، في الجسم الحي وسيليكون ولكل منها مزايا وعيوب في الدراسات المختبرية لديها عيب أساسي لإزالة الخلايا من بيئتها الطبيعية، وبالتالي قد لا تتكاثر آثار ينظر في حالها. الحيوانات الحية. في الجسم الحي تقنيات توفير لتعزيز النسخ التجريبية من الحالات المرضية مع زيادة أهمية متعدية. وفي سيليكون وتشير بصفة عامة إلى النمذجة الحاسوبية من مرض أو عملية الخلوية، وحين تستخدم بشكل متزايد لدراسة التفاعلات المخدرات المحتملة للامتحانسبيل، ما زال يتعين اختبار أي معلومات استقاها في الخلايا أو الأنسجة الحية.
يجب أن النموذج المثالي من السكتة الدماغية في إعداد مختبر تظهر ملامح مرضية مشابهة لتلك التي ظهرت في عدد السكان. في حين أن هناك خصائص مشتركة الفسيولوجية من السكتة الدماغية في البشر، وهناك أيضا العديد من الاختلافات تبعا لنوع الإصابة من ذوي الخبرة. السكتة الدماغية في البشر كما يحدث انسداد صغيرة أو كبيرة سفينة، والآفات نزفية، والشريان إلى الشريان أو الانسدادات القلب والتي تؤدي إلى احتشاء أحجام متنوعة فضلا عن الاختلافات في الآليات المتعلقة بكل علم الأمراض. الاستفادة من استخدام نماذج السكتة الدماغية الحيوان هو الجيل من عوائق استنساخه التي تحاكي خصائص السكتة الدماغية الإنسان. وتشمل النماذج الأكثر شيوعا السكتة الدماغية الحيوان انسداد الشريان باستخدام: وسط انسداد الشريان الدماغي (أساليب خيوط صمية أو اللف) التي نماذج القاصي MCAO ونموذج photothrombosis. مزايا لوقد استعرض د عيوب كل نموذج في مكان آخر (انظر 4 و 5). نماذج عالمية الدماغية (MCAO)، في حين أن من السهل نسبيا لأداء هي أقل أهمية من السكتة الدماغية البشرية من هي نماذج السكتة الدماغية التنسيق. وبالإضافة إلى ذلك، وهذه الأساليب تختلف اختلافا كبيرا في إحداث تقرحات احتشاء الدماغ استنساخه. نموذج photothrombosis هو تكرار للغاية طالما يتحكم المجرب التجارب بشكل جيد، وتوفير ميزة واضحة على نماذج MCAO. ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى الأوعية الدموية الدقيقة إهانة وقد وصفت نموذج لعرض غبش الدماغية الحد الأدنى، المنطقة التي يعتقد أن الخلايا لتكون انقاذها 6،7. بالإضافة إلى ذلك، وذمة وعائية المنشأ وتشكيل السامة للخلايا وذمة ويمكن أيضا أن يتسبب الإشعاع التالي من منطقة التصوير. على الرغم من هذه القيود وفرت تقنية نظرة جديدة في العديد من العمليات الفسيولوجية التالية السكتة الدماغية 8، 9، 10، 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
ابتليت القدرة على ترجمة التجريبية الفيزيولوجيا المرضية السكتة الدماغية من الحيوان إلى الإنسان التطبيق مع الفشل. ومع ذلك، فإن استخدام نماذج حيوانية، مثل نموذج photothrombosis، ويسمح لفهم أفضل للالسكتة الدماغية الفيزيولوجيا المرضية واستكشاف طرق علاجية جديدة لتوفير الحماي…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for this work was provided by: AG007218 and NIH F32 AG031606.
Images were generated in the Core Optical Imaging Facility, which is supported by UTHSCSA, NIH-NCI P30 CA54174 (CTRC at UTHSCSA) and NIH-NIA P01AG19316.
Materials
| Reagents | |||
| Rose Bengal | Sigma | 330000 | |
| Isoflurane Anesthetic | MWI Veterinary Supply | 088-076 | |
| Vetbond | 1469SB | 1469SB | |
| aCSF | 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4). | ||
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Dissecting Scissors | Bioindustrial Products | 500-410 | |
| Operating scissors 14 cm | Bioindustrial Products | 12-055 | |
| Forceps Dumont High Tech #5 style, straight | Bioindustrial Products | TWZ-301.22 | |
| LabJack 132X80 | Optosigma Co | 123-6670 | |
| Platform for Labjack 8X 8 | Optosigma Co | 145-1110 | |
| Ear bar holder from stereotaxic setup | Stoelting/Cyborg | 51654 | |
| Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine | DRE, Inc. | 15001 | |
| Tech IV Isoflurane vaporizer | DRE, Inc. | 34001 | |
| F Air Canister | DRE, Inc | 80120 | |
| Bain circuit breathing tube | DRE, Inc | 86111B | |
| Rodent adapter for bain tube | DRE, Inc | 891000 | |
| O2 regulator for oxygen tanks | DRE, Inc | CE001E | |
| Rodent induction chamber | DRE, Inc | 15004C | |
| Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle | Suture Express | 1639G | |
| Objective inverter Optical Adapter | LSM technologies | ||
| Foredom drill Dual voltage 110/120 | Foredom | 134.53 |
Riferimenti
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17, 497-504 (1985).
- Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40, 320-328 (1977).
- Owens, A. P., Mackman, N. Sources of tissue factor that contribute to thrombosis after rupture of an atherosclerotic plaque. Thrombosis Research. 129, S30-S33 (2012).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2, 396-409 (2005).
- . . Manual of stroke models in rats. , (2009).
- Herz, R. C., Kasbergen, C. M., Hillen, B., Versteeg, D. H., de Wildt, D. J. Rat middle cerebral artery occlusion by an intraluminal thread compromises collateral blood flow. Brain Research. 791, 223-228 (1998).
- Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism : Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 8, 474-485 (1988).
- Zheng, W., et al. Purinergic receptor stimulation reduces cytotoxic edema and brain infarcts in mouse induced by photothrombosis by energizing glial mitochondria. PloS One. 5, e14401 (2010).
- Zheng, D. M., Wewer, J., Lechleiter, J. P. 2. Y. 1. R. -. i. n. i. t. i. a. t. e. d. IP3R-dependent stimulation of astrocyte mitochondrial metabolism reduces and partially reverses ischemic neuronal damage in mouse. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 600-611 (2013).
- Witte, O. W., Stoll, G. Delayed and remote effects of focal cortical infarctions: secondary damage and reactive plasticity. Advances in Neurology. 73, 207-227 (1997).
- Hagemann, G., Redecker, C., Neumann-Haefelin, T., Freund, H. J., Witte, O. W. Increased long-term potentiation in the surround of experimentally induced focal cortical infarction. Annals of Neurology. 44, 255-258 (1998).
- Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
- Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 12670-12675 (2010).
- Nishimura, N., Rosidi, N. L., Iadecola, C., Schaffer, C. B. Limitations of collateral flow after occlusion of a single cortical penetrating arteriole. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30, 1914-1927 (2010).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 365 (2007).
- Blum, S., et al. Memory after silent stroke: Hippocampus and infarcts both matter. Neurology. 78, 38-46 (2012).
- Heinsius, T., Bogousslavsky, J., Van Melle, G. Large infarcts in the middle cerebral artery territory Etiology and outcome patterns. Neurology. 50, 341-350 (1998).
- Wardlaw, J. What causes lacunar stroke. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 76, 617-619 (2005).
- Inoue, Y., et al. Ischemic stroke under anticoagulant therapy]. Rinsho shinkeigaku. Clinical Neurology. 50, 455-460 (2010).
- Tiannan Wang, W. C., Xie, Y., Zhang, W., Ding, S. Controlling the Volume of the Focal Cerebral Ischemic Lesion through Photothrombosis. American Journal of Biomedical Sciences. 2, 33-42 (2009).
- Head, B. P., Patel, P. Anesthetics and brain protection. Current Opinion in Anaesthesiology. 20, 395-399 (2007).
- Kirsch, J. R., Traystman, R. J., Hurn, P. D. Anesthetics and cerebroprotection: experimental aspects. International Anesthesiology Clinics. 34, 73-93 (1996).
- Koerner, I. P., Brambrink, A. M. Brain protection by anesthetic agents. Current Opinion in Anaesthesiology. 19, 481-486 (2006).
- Gelb, A. W., Bayona, N. A., Wilson, J. X., Cechetto, D. F. Propofol anesthesia compared to awake reduces infarct size in rats. Anesthesiology. 96, 1183-1190 (2002).
- Bhardwaj, A., Castro, I. A., Alkayed, N. J., Hurn, P. D., Kirsch, J. R. Anesthetic choice of halothane versus propofol: impact on experimental perioperative stroke. Stroke; A Journal Of Cerebral Circulation. 32, 1920-1925 (2001).
- Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6, 511-512 (2009).
