Confocal ऑप्टिकल इमेजिंग द्वारा गुलाब बंगाल Photothrombosis<em> Vivo</em>: एक पोत स्ट्रोक का एक मॉडल
Summary
Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.
Abstract
In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.
Introduction
तुरंत गुलाब बंगाल के शामिल होने के बाद में विवो सेलुलर प्रतिक्रियाओं की तकनीक का वर्णन किया परमिट दृश्य एक अक्षुण्ण माउस में photothrombosis। गुलाब बंगाल (4,5,6,7-tetrachloro -2 ',' 4, 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) पशु मॉडल में इस्कीमिक स्ट्रोक (माउस और चूहा) को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल एक सहज डाई है। एक 564 एनएम लेजर प्रकाश के साथ एक पतला खोपड़ी के माध्यम से पूंछ नस और बाद रोशनी के माध्यम से आरबी की एक सांस में इंजेक्शन के बाद, एक थक्का एक शारीरिक स्ट्रोक 1 के कारण प्रेरित किया जाता है। विधि मूल रूप से 1977 में Rosenblum और अल-Sabban द्वारा वर्णित किया गया था, और बाद में 1980 के दशक के मध्य 1,2 में वाटसन द्वारा रूपांतरित किया गया। संक्षेप में, गुलाब बंगाल बाद में ऊतक कारक, जमावट झरना की एक सर्जक को सक्रिय करता है जो प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन, उत्पन्न करता है जो हरे रंग उत्तेजना प्रकाश (हमारे मामले में 561 एनएम लेजर), के साथ विकिरणित है। जमावट झरना की प्रेरण लेस एक इस्कीमिक का उत्पादननैदानिक स्ट्रोक से 3 विकृतिविज्ञानी प्रासंगिक है कि आयन।
स्ट्रोक न्यूरॉन्स, glia, अन्तःचूचुक और प्रतिरक्षा प्रणाली सहित कई विभिन्न कोशिकाओं प्रकार की परस्पर क्रिया की वजह से एक जटिल pathophysiology है। बेहतरीन तकनीक का चयन एक विशेष सेलुलर प्रक्रिया कई विचार की आवश्यकता का अध्ययन करने के लिए। प्रायोगिक तकनीक को तीन श्रेणियों में से एक में मोटे तौर पर गिरावट: इन विट्रो में, प्रत्येक होने के फायदे और नुकसान के साथ vivo में और सिलिको में इन विट्रो अध्ययन में उनके प्राकृतिक वातावरण से कोशिकाओं को हटाने के प्राथमिक नुकसान है और इसलिए एक अक्षुण्ण में देखा प्रभाव पुन: पेश नहीं हो सकता है। पशु रह रहे हैं। में vivo तकनीक में वृद्धि हुई अनुवादकीय महत्व के साथ रोग राज्यों की बढ़ी प्रयोगात्मक नकल के लिए प्रदान करते हैं। सिलिको में आम तौर पर एक रोग या सेलुलर प्रक्रिया के कंप्यूटर मॉडलिंग करने के लिए संदर्भित करता है, और तेजी से परीक्षा के लिए संभावित दवा बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोग करते हुएमिसाल, gleaned किसी भी जानकारी को अभी भी कोशिकाओं या जीवित ऊतक में परीक्षण किया जाना चाहिए।
प्रयोगशाला स्थापित करने में स्ट्रोक का एक आदर्श मॉडल मानव आबादी में देखा उन लोगों के लिए इसी तरह के रोग सुविधाओं का प्रदर्शन करना चाहिए। मानव आबादी में स्ट्रोक के आम शारीरिक विशेषताओं कर रहे हैं, अनुभवी चोट के प्रकार पर निर्भर करता है वहाँ भी कई मतभेद हैं। मानव आबादी में स्ट्रोक विभिन्न रोधगलितांश संस्करणों के साथ ही प्रत्येक विकृति से संबंधित तंत्र में मतभेद है कि परिणाम में के रूप में छोटे या बड़े पोत occlusions, रक्तस्रावी घावों, और धमनी या कार्डियो-embolisms धमनी के लिए होता है। पशु स्ट्रोक मॉडल के उपयोग का लाभ मानव स्ट्रोक की विशेषताओं है कि नकल प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दौरे की पीढ़ी है। मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (embolic या endovascular रेशा तरीकों) मॉडल जो बाहर का MCAO और photothrombosis मॉडल: सबसे आम पशु स्ट्रोक मॉडल का उपयोग धमनी रोड़ा शामिल हैं। फायदे एकप्रत्येक मॉडल की घ नुकसान (4 देख सकते हैं और 5) अन्यत्र समीक्षा की गई है। ग्लोबल इस्कीमिक मॉडल (MCAO), प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान फोकल स्ट्रोक मॉडल हैं की तुलना में मानव स्ट्रोक के लिए कम प्रासंगिक हैं। इसके अलावा, इन तरीकों प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मस्तिष्क रोधगलितांश घावों उत्प्रेरण में अत्यधिक चर रहे हैं। प्रयोगकर्ता MCAO मॉडल पर एक स्पष्ट लाभ प्रदान करने, अच्छी तरह से अपने प्रयोगों के नियंत्रण के रूप में photothrombosis मॉडल लंबे समय के रूप में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। हालांकि, की वजह microvasculature अपमान करने के लिए मॉडल एक न्यूनतम इस्कीमिक Penumbra, कोशिकाओं 6,7 salvageable माना जाता है जहां क्षेत्र प्रदर्शित करने के लिए वर्णित किया गया है। इसके अतिरिक्त, vasogenic शोफ और साइटोटोक्सिक शोफ गठन भी इमेजिंग क्षेत्र के निम्नलिखित विकिरण प्रेरित किया जा सकता है। इन सीमाओं के बावजूद तकनीक स्ट्रोक 8, 9, 10, 11 निम्नलिखित कई शारीरिक प्रक्रियाओं में नए अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मानव आवेदन करने के लिए पशु से प्रयोगात्मक स्ट्रोक pathophysiology अनुवाद करने की क्षमता की विफलता के साथ ग्रस्त हो गया है। हालांकि, इस तरह photothrombosis मॉडल के रूप में पशु मॉडल, के उपयोग में सुधार स्ट्रोक pathophysiology की समझ और…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for this work was provided by: AG007218 and NIH F32 AG031606.
Images were generated in the Core Optical Imaging Facility, which is supported by UTHSCSA, NIH-NCI P30 CA54174 (CTRC at UTHSCSA) and NIH-NIA P01AG19316.
Materials
| Reagents | |||
| Rose Bengal | Sigma | 330000 | |
| Isoflurane Anesthetic | MWI Veterinary Supply | 088-076 | |
| Vetbond | 1469SB | 1469SB | |
| aCSF | 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4). | ||
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Dissecting Scissors | Bioindustrial Products | 500-410 | |
| Operating scissors 14 cm | Bioindustrial Products | 12-055 | |
| Forceps Dumont High Tech #5 style, straight | Bioindustrial Products | TWZ-301.22 | |
| LabJack 132X80 | Optosigma Co | 123-6670 | |
| Platform for Labjack 8X 8 | Optosigma Co | 145-1110 | |
| Ear bar holder from stereotaxic setup | Stoelting/Cyborg | 51654 | |
| Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine | DRE, Inc. | 15001 | |
| Tech IV Isoflurane vaporizer | DRE, Inc. | 34001 | |
| F Air Canister | DRE, Inc | 80120 | |
| Bain circuit breathing tube | DRE, Inc | 86111B | |
| Rodent adapter for bain tube | DRE, Inc | 891000 | |
| O2 regulator for oxygen tanks | DRE, Inc | CE001E | |
| Rodent induction chamber | DRE, Inc | 15004C | |
| Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle | Suture Express | 1639G | |
| Objective inverter Optical Adapter | LSM technologies | ||
| Foredom drill Dual voltage 110/120 | Foredom | 134.53 |
Riferimenti
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