共焦点光学イメージングによるローズベンガル光血栓<em>インビボ</em>：単一の容器ストロークのモデル
Summary
Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.
Abstract
In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.
Introduction
技術はすぐにそのままマウスでローズベンガル光血栓の誘導後のインビボ細胞応答の許可の可視化について説明しました。ローズベンガル（4,5,6,7-テトラクロロ-2 '、4'、5 '、7'-テトラヨード）は、動物モデルにおける虚血性脳卒中（マウス及びラット）を誘導するために使用される感光性染料です。 564 nmのレーザー光を薄く頭蓋骨を介して尾静脈を介して後続の照明RBのボーラス注射に続いて、血栓が生理的発作を引き起こし1に誘導されます。この方法は、もともと1977年にローゼンブラム、エル·Sabbanによって記述し、それ以降の1980年代半ば1,2にワトソンによって適応されました。要するに、ローズベンガルは、その後、組織因子、凝固カスケードの開始剤を活性化し、活性酸素種の生産を生成緑色励起光（この場合は561 nmレーザー）を照射します。凝固カスケードの誘導は虚血性レを生成します臨床ストローク3に病理学的に関連するイオン。
脳卒中は、ニューロン、グリア、内皮および免疫系を含む多くの異なる細胞タイプの相互作用に起因する複雑な病態生理を持っています。特定の細胞プロセスを研究するための最良の方法を選択すると、複数の配慮が必要です。実験技術は、3つのカテゴリのいずれかに広く分類さ： インビトロ 、 インビボ及びそれぞれが長所と短所とインシリコin vitro試験は、それらの天然の環境から細胞を除去する主な欠点を持っているので、そのままで見られる効果を再現できない場合があり、動物を生きた。in vivoでの技術増加翻訳意義と病態の強化実験的複製を提供する。 インシリコ一般的疾患または細胞プロセスのコンピュータモデリングを参照して、ますます試験の潜在的な薬物相互作用を研究するために利用しながら、PLE、収集されたすべての情報は、まだ生きている細胞や組織で試験されなければなりません。
実験室の設定における脳卒中の理想的なモデルは、ヒト集団において見られるものと同様の病理学的特徴を実証する必要があります。ヒト集団において脳卒中の一般的な生理学的特性がありますが、経験した損傷の種類に応じて多くの違いもあります。ヒト集団においてストロークを変化させ、梗塞ボリュームだけでなく、それぞれの病状に関連するメカニズムの違いをもたらすような小さなまたは大血管閉塞、出血性病変、および動脈または心臓塞栓動脈に発生します。動物の脳卒中モデルを利用する利点は、人間のストロークの特性を模倣再現性梗塞の発生です。中大脳動脈閉塞（塞栓または血管内フィラメント法）をモデル遠位MCAOおよび光血栓モデル：もっとも一般的な動物ストロークモデルが使用して動脈閉塞が含まれます。利点各モデルのd欠点は（ 図4、図5を参照してください）他の場所で検討されています。グローバル虚血モデル（MCAO）、実行するのが比較的容易に焦点脳卒中モデルであるよりも、人間のストロークにはあまり関連していました。さらに、これらの方法は、再現性の脳梗塞病変を誘導するのに非常に可変です。実験者は、MCAOモデル上で明確な利点を提供し、よく彼らの実験を制御するように光血栓モデルがあれば高い再現性です。しかし、微小血管傷害のモデルは、最小限虚血性ペナンブラ、細胞を救出6,7であると考えられる領域を表示することが記載されています。また、血管原性浮腫及び細胞毒性浮腫形成はまた、撮像領域の照射後の誘導され得ます。これらの制限にもかかわらず、技術は、脳卒中8、9、10、11以下の多くの生理学的プロセスに新たな洞察を提供しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
動物からヒトへの適用に実験的なストローク病態生理を変換する機能は、障害に悩まされています。しかし、このような光血栓モデルなどの動物モデルの使用は、改良されたストローク病態生理の理解と脳卒中後の神経保護を提供するための新しい治療法の探求を可能にします。光血栓モデルによって生成される小さな皮質ストロークとmicroinfarctionsは、臨床的に無症状または高い有病率を持…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for this work was provided by: AG007218 and NIH F32 AG031606.
Images were generated in the Core Optical Imaging Facility, which is supported by UTHSCSA, NIH-NCI P30 CA54174 (CTRC at UTHSCSA) and NIH-NIA P01AG19316.
Materials
| Reagents | |||
| Rose Bengal | Sigma | 330000 | |
| Isoflurane Anesthetic | MWI Veterinary Supply | 088-076 | |
| Vetbond | 1469SB | 1469SB | |
| aCSF | 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4). | ||
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Dissecting Scissors | Bioindustrial Products | 500-410 | |
| Operating scissors 14 cm | Bioindustrial Products | 12-055 | |
| Forceps Dumont High Tech #5 style, straight | Bioindustrial Products | TWZ-301.22 | |
| LabJack 132X80 | Optosigma Co | 123-6670 | |
| Platform for Labjack 8X 8 | Optosigma Co | 145-1110 | |
| Ear bar holder from stereotaxic setup | Stoelting/Cyborg | 51654 | |
| Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine | DRE, Inc. | 15001 | |
| Tech IV Isoflurane vaporizer | DRE, Inc. | 34001 | |
| F Air Canister | DRE, Inc | 80120 | |
| Bain circuit breathing tube | DRE, Inc | 86111B | |
| Rodent adapter for bain tube | DRE, Inc | 891000 | |
| O2 regulator for oxygen tanks | DRE, Inc | CE001E | |
| Rodent induction chamber | DRE, Inc | 15004C | |
| Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle | Suture Express | 1639G | |
| Objective inverter Optical Adapter | LSM technologies | ||
| Foredom drill Dual voltage 110/120 | Foredom | 134.53 |
Riferimenti
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