Rose Bengal Photothrombosis av Confocal Optical Imaging<em> I Vivo</em>: En modell av enkelt Vessel Stroke

Summary

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Abstract

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.

The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Introduction

Den teknikk som er beskrevet tillater visualisering av in vivo cellulære responser umiddelbart etter induksjonen av Rose Bengal photothrombosis i et intakt mus. Rose Bengal (4,5,6,7-tetraklor-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) er et fotosensitivt fargestoff som brukes for å indusere iskemisk slag hos dyremodeller (mus og rotter). Etter en bolus-injeksjon av RB gjennom halevenen, og etterfølgende belysning gjennom en hodeskalle tynnet med et 564 nm laserlys, er en trombe induserte forårsaker en fysiologisk slag ^1. Metoden ble opprinnelig beskrevet av Rosenblum og El-Sabban i 1977, og ble senere tilpasset av Watson i midten av 1980-tallet ^1,2. I korte trekk, blir Rose Bengal bestrålt med grønt eksitasjonslys (561 nm laser i vårt tilfelle), som genererer produksjon av reaktive oksygenforbindelser, som deretter aktiverer vev faktor, en initiator av koagulasjonskaskaden. Induksjon av koagulasjonskaskaden bringer en iskemisk lesion som er patologisk relevant for klinisk hjerneslag ^tre.

Stroke har en kompleks patofysiologien grunn av samspillet av mange forskjellige celletyper, inkludert neuroner, gliaceller, endotel og immunsystemet. Velge den beste teknikken for å studere en bestemt cellulær prosess krever flere hensyn. Eksperimentelle teknikker faller grovt i en av tre kategorier: in vitro, in vivo og in silico med hver har fordeler og ulemper In vitro studier har den primære ulempe med å fjerne cellene fra sitt naturlige miljø, og kan derfor ikke gjengi virkninger sett i et intakt,. levende dyr. In vivo-teknikker sørger for forbedret eksperimentell replikasjon av sykdomstilstander med økt translasjonelle betydning. In silico refererer generelt til datamaskinmodellering av en sykdom eller cellulær prosess, og samtidig i økende grad anvendt for å studere mulige interaksjoner for undersøkelseple, må all informasjon sanket fortsatt testes i levende celler eller vev.

Den ideelle modellen av hjerneslag i laboratoriet innstillingen bør vise tilsvarende patologiske funksjoner til de som er sett i den menneskelige befolkning. Mens det er vanlige fysiologiske kjennetegn ved slag i den menneskelige befolkning, er det også mange forskjeller avhengig av den type skade opplevd. Hjerneslag i befolkningen forekommer som små eller store fartøy okklusjon, hemoragisk lesjoner og arterie-til arterie eller cardio-embolisms som resulterer i varierte infarktvolum samt forskjeller i mekanismer knyttet til hver patologi. Fordelen med å benytte dyr takts modellene er den generasjonen av reproduserbare infarkter som etterligner egenskapene til menneskets hjerneslag. De vanligste dyre takts modellene inkluderer arterieokklusjon hjelp: midten cerebral arterie okklusjon (emboliske eller endovaskulære gløde metoder) som modeller distal MCAO og photothrombosis modell. Fordelene end ulemper ved hver modell er gjennomgått andre steder (se ⁴ og ^5). Global iskemiske modeller (MCAO), mens relativt enkelt å utføre er mindre relevant for menneskelig slag enn er fokale slag modeller. I tillegg er disse fremgangsmåter er svært variabel i indusering av reproduserbare hjernen infarkt lesjoner. Den photothrombosis modellen er svært reproduserbare så lenge eksperimentator styrer sine eksperimenter godt, og gir en klar fordel over MCAO modeller. Men på grunn av mikrovaskulaturen fornærmelse modellen har blitt beskrevet å vise en minimal iskemisk penumbra, området hvor celler er antatt å være salvageable ^6,7. I tillegg kan vasogenic ødem og cytotoksiske ødemdannelse også indusert etter bestråling av bildeområdet. Til tross for disse begrensninger teknikken har gitt ny innsikt i mange fysiologiske prosesser etterfulgt av slag ^{8, 9, 10, 11.}

Protocol

Merk: Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Texas Health Science Center San Antonio og var i samsvar med de ankommer retningslinjer. 1. bedøvelse for Kortikal Forberedelse Plasser musen i en induksjon kammer med 2-3% isofluorane blandes med oksygen for å indusere anestesi. Observere respirasjonsfrekvens nedgang som musen er indusert. Knip labben på musen for å avgjøre om musen er klar til å flytte til nesen membran. M…

Representative Results

Formålet med denne metoden er å indusere en iskemisk slag hos dyremodeller (mus og rotter) etter en bolusinjeksjon av RB gjennom halevenen og etterfølgende belysning av en hodeskalle tynnet med en 561 nm laser lys. Bildene i Figur 4 viser utviklingen av klumpdannelse i et enkelt kar etter bestråling av området på 0, 1, 1,5 og 2 min. Før dannelse av blodpropper hele fartøyet er hvitt på grunn av fri flyt Rose Bengal. Etter induksjon av bestråling av fartøyet er det en åpenbar mørkere i porsj…

Discussion

Evnen til å oversette eksperimentell hjerneslag patofysiologien fra dyr til menneske søknaden har vært plaget med fiasko. Men bruk av dyremodeller, slik som photothrombosis modellen, gir mulighet for bedre forståelse av patofysiologien slag og utforskning av nye terapeutiske tilnærminger for å gi nevrobeskyttelse etter et slag. Små kortikale slag og microinfarctions produsert av photothrombotic modellen er klinisk relevant å subklinisk eller "silent" slag ^13-15, som har en høy utbredelse og…

Materials

			Reagents
Rose Bengal	Sigma	330000
Isoflurane Anesthetic	MWI Veterinary Supply	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).
			[header]
			Equipment
Dissecting Scissors	Bioindustrial Products	500-410
Operating scissors 14 cm	Bioindustrial Products	12-055
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight	Bioindustrial Products	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Platform for Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
Ear bar holder from stereotaxic setup	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine	DRE, Inc.	15001
Tech IV Isoflurane vaporizer	DRE, Inc.	34001
F Air Canister	DRE, Inc	80120
Bain circuit breathing tube	DRE, Inc	86111B
Rodent adapter for bain tube	DRE, Inc	891000
O2 regulator for oxygen tanks	DRE, Inc	CE001E
Rodent induction chamber	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle	Suture Express	1639G
Objective inverter Optical Adapter	LSM technologies
Foredom drill Dual voltage 110/120	Foredom	134.53