Rose Bengal Photothrombosis av Confocal optisk avbildning<em> In Vivo</em>: En modell av enda kärl Stroke

Summary

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Abstract

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.

The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Introduction

Den beskrivna tekniken medger visualisering av cellulära svar in vivo omedelbart efter induktion av Rose Bengal photothrombosis i en intakt mus. Rose Bengal (4,5,6,7-tetraklor-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) är ett fotokänsligt färgämne som används för att inducera ischemisk stroke i djurmodeller (mus och råtta). Efter en bolusinjektion av RB genom svansvenen och efterföljande belysning genom en förtunnad skalle med en 564 nm laserljus, är en tromb inducerad orsakar en fysiologisk slaganfall ^1. Metoden beskrevs ursprungligen av Rosenblum och El-Sabban 1977, och senare anpassas av Watson i mitten av 1980-talet ^1,2. I korthet, är Rose Bengal bestrålas med grönt excitationsljus (561 nm laser i vårt fall), som genererar produktion av reaktiva syrespecies, som därefter aktiverar vävnadsfaktor, en initiator av koagulationskaskaden. Induktion av koagulationskaskaden ger en ischemisk lesjon som är patologiskt relevanta för klinisk stroke ^3.

Stroke har en komplex patofysiologi på grund av samspelet mellan många olika celltyper inklusive nervceller, glia, endotel och immunförsvaret. Att välja den bästa tekniken för att studera en särskild cellulär process kräver flera överväganden. Experimentella tekniker faller i stort sett in i tre kategorier: in vitro, in vivo och in silico med var och en har fördelar och nackdelar In vitro-studier har det primära nackdelen med att avlägsna celler från sin naturliga miljö och kan därför inte återge effekter ses i en intakt,. levande djur. In vivo-tekniker ge förbättrad experimentell replikering av sjukdomstillstånd med ökad translationell betydelse. I silico hänvisar generellt till datormodellering av en sjukdom eller cellulär process, och samtidigt allt mer används för att studera potentiella läkemedelsinteraktioner för examenpel måste alla uppgifter som inkommit fortfarande testas i levande celler eller vävnad.

Den idealiska modellen för stroke i laboratoriemiljö bör visa liknande patologiska funktioner till de som sågs i den mänskliga befolkningen. Även om det finns gemensamma fysiologiska egenskaper av stroke i den mänskliga befolkningen, det finns också många skillnader beroende på vilken typ av skada upplevt. Stroke i den mänskliga befolkningen sker som små eller stora kärl ocklusioner, hemorragiska skador och artär till artär eller hjärt-emboli som resulterar i varierande infarktvolymer samt skillnader i mekanismer i samband med varje patologi. Fördelen med att använda djur stroke modeller är genereringen av reproducerbara infarkter som efterliknar egenskaperna hos människa stroke. De vanligaste djur stroke modeller inkluderar artärocklusion använder: mellersta cerebral artär ocklusion (emboli eller endovaskulära glöd metoder) vilka modeller distala kortex och photothrombosis modellen. Fördelarna end nackdelar med varje modell har granskats på annat håll (se ⁴ och ^5). Globala ischemiska modeller (MCAO), medan relativt lätt att utföra är mindre relevanta för människors slaget än är fokala strokemodeller. Dessutom är dessa metoder är mycket variabel i inducering reproducerbara hjärninfarkt lesioner. Den photothrombosis modellen är mycket reproducerbar så länge försöks styr sina experiment väl, vilket ger en klar fördel gentemot kortex modeller. Men på grund av mikrovaskulaturen förolämpa modellen har beskrivits för att visa en minimal ischemisk halvskugga, det område där celler tros vara salvageable ^6,7. Dessutom kan vasogent ödem och cytotoxiskt ödembildning också induceras efter bestrålning av avbildningsområdet. Trots dessa begränsningar tekniken har gett ny insikt i många fysiologiska processer efter stroke ^{8, 9, 10, 11.}

Protocol

Obs! Alla djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Texas Health Science Center i San Antonio och överensstämde med de anländer riktlinjer. 1. anesthetizing för kortikal Framställning Placera musen i en induktionskammare med 2-3% isofluoran blandas med syre för att inducera anestesi. Observera andningsfrekvensen minskar när musen induceras. Nyp tass på musen för att bestämma om mus är redo att flytta till noskon…

Representative Results

Syftet med denna metod var att inducera en ischemisk stroke i djurmodeller (mus och råtta) efter en bolusinjektion av RB genom svansvenen och efterföljande belysning av en förtunnad skalle med en 561 nm laserljus. Bilderna i fig 4 demonstrerar utvecklingen av koagelbildning inom ett enda kärl efter bestrålning av området vid 0, 1, 1,5 och 2 min. Före koagelbildning hela kärlet är vit på grund av fririnnande Rose Bengal. Efter induktionen av bestrålning av kärlet finns det en uppenbar mörkf?…

Discussion

Förmågan att omsätta experimentella stroke patofysiologi från djur till människa har plågats med misslyckande. Men användningen av djurmodeller, såsom photothrombosis modellen möjliggör ökad förståelse av stroke patofysiologi och utforskandet av nya behandlingsmetoder för att ge neuroprotektion efter en stroke. Små kortikala stroke och microinfarctions produceras av photothrombotic modellen är kliniskt relevant för subklinisk eller "tyst" stroke ^13-15, som har en hög förekomst och…

Materials

			Reagents
Rose Bengal	Sigma	330000
Isoflurane Anesthetic	MWI Veterinary Supply	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).
			[header]
			Equipment
Dissecting Scissors	Bioindustrial Products	500-410
Operating scissors 14 cm	Bioindustrial Products	12-055
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight	Bioindustrial Products	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Platform for Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
Ear bar holder from stereotaxic setup	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine	DRE, Inc.	15001
Tech IV Isoflurane vaporizer	DRE, Inc.	34001
F Air Canister	DRE, Inc	80120
Bain circuit breathing tube	DRE, Inc	86111B
Rodent adapter for bain tube	DRE, Inc	891000
O2 regulator for oxygen tanks	DRE, Inc	CE001E
Rodent induction chamber	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle	Suture Express	1639G
Objective inverter Optical Adapter	LSM technologies
Foredom drill Dual voltage 110/120	Foredom	134.53