Detectie van Axonally Gelokaliseerde mRNA in Brain secties met behulp van High-Resolution<em> In Situ</em> Hybridisatie
Summary
RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.
Abstract
mRNA's worden vaak gelokaliseerd op gewervelde axonen en hun lokale vertaling nodig is voor axon pathfinding of vertakking tijdens de ontwikkeling en voor onderhoud, reparatie of neurodegeneratie in postdevelopmental periodes. High throughput analyses hebben onlangs onthuld dat axonen hebben een meer dynamische en complexe transcriptoom dan eerder werd verwacht. Deze analyse, maar zijn meestal gedaan in gekweekte neuronen wanneer axonen kunnen worden geïsoleerd uit de somato-dendritische compartimenten. Het is vrijwel onmogelijk om dergelijke scheiding bereiken geheel weefsels in vivo. Aldus, teneinde de werving van mRNA en hun functionele relevantie verifiëren in een geheel dier, transcriptoom analyse idealiter worden gecombineerd met technieken die de visualisatie van mRNA in situ mogelijk. Onlangs hebben roman ISH technologieën die RNA's in een enkel-molecuul niveau te detecteren ontwikkeld. Dit is vooral belangrijk wanneer de analyse van de subcellulaire lokalisatie van mRNA, Omdat gelokaliseerde RNA's zijn doorgaans te vinden op een laag niveau. Hier beschrijven we twee protocollen voor de detectie van axonally-mRNA gelokaliseerd met behulp van een nieuwe ultragevoelige RNA ISH techniek. We hebben samen RNAscope ISH met axonen tegenkleuring met behulp van fluorescentie immunohistochemie of histologische kleurstoffen voor de aanwerving van ATF4 mRNA om axonen in vivo in de volwassen muis en menselijke hersenen te controleren.
Introduction
Axonal mRNA werving en lokale vertaling staat axonen te reageren op extracellulaire stimuli in een tijdelijk en ruimtelijk acute manier 1. Intra-axonen eiwitsynthese wordt het best begrepen in de context van neurodevelopment waar het speelt een cruciale rol in de groei kegel gedrag 2-8, axon pathfinding 9-11 en retrograde signalering 12,13. Maar veel minder bekend over de functionele betekenis van axonale eiwitsynthese in post-ontwikkelings neuronen bij axonale mRNA en ribosoom niveaus sterk gereduceerd 14,15. Volwassen gewervelde axonen hebben lange tijd gedacht translationeel inactief 16 te zijn. Echter, recente studies tonen aan dat de lokale vertaling wordt geactiveerd in volwassen axonen onder pathologische omstandigheden. Zo wordt een gedeelte van mRNA's gerekruteerd voor regenererende axons na zenuwletsel en intra-axonale eiwitsynthese is die voor een doelmatige regeneratie van axons die 17. Bovendien, onze groep has aangetoond dat specifieke mRNAs worden gerekruteerd voor axons na plaatselijke blootstelling aan de ziekte van Alzheimer Aß peptide 1-42 en lokale translatie van de transcriptiefactor ATF4 moet het neurodegeneratieve effect van Aß 1-42 propageren van axonen in de neuronale soma 18. Tenslotte hebben high throughput analyse bleek dat de volwassen axonen een complexer en dynamische transcriptoom dan verwacht 18-21, in het bijzonder onder pathologische omstandigheden. Gezien deze studies, een zeer gevoelige en specifieke methode voor het opsporen axonally gelokaliseerde mRNA's in het volwassen zenuwstelsel nodig.
Veel van het werk op mRNA werving en lokale vertaling in het volwassen axonen is uitgevoerd op gekweekte neuronen. Dit geldt vooral voor transcriptoom analyse sindsdien gespecialiseerd kweekmethoden bestaan die de isolatie van axonen van de somato-dendritische compartimenten 18-20 toe. Hoewel dergelijke studies waardevolle ins hebben gegevenechts in de rol van de lokale vertaling in volwassen axonen, de vraag of gekweekte neuronen getrouw beeld geeft van de situatie in vivo of als mRNA recruitment is een adaptieve reactie van axonen te kweken voorwaarden is nog open. Weinig studies hebben het bewijs van mRNA rekrutering axonen rijpen in vivo voorzien. Zo is het transcript coderend voor het olfactorische markereiwit aangetroffen in neuronen van volwassen sensorische neuronen 22. Een transgen met de 3 'UTR van β-actine mRNA wordt getransporteerd naar axonen in het perifere en centrale zenuwstelsel neuronen bij muizen en lokaal vertaald naar ontwikkelings- periode 23. Lamin b2 mRNA is gelokaliseerd op het netvlies axonen in Xenopues laevis kikkervisjes en de uitputting van invloed axon onderhoud na axonale ontwikkeling 21. Interferentie met het axonale transport van het mRNA dat codeert voor cytochroom C oxidase IV verandert muisgedrag 24. Tenslotte ATF4 mRNA wordt gevonden bij volwassen eenXON van muizen en menselijke hersenen in het kader van Aß 1-42 geïnduceerde neurodegeneratie 18.
Hoge doorvoer transcriptoom analyses hebben bewezen nuttig te zijn om mRNA profielen in geïsoleerde axonen in vitro te identificeren, maar hebben beperkingen voor in vivo studies sinds geheel weefsels axonen zijn nooit gevonden in afzondering, maar vermengd met neuronale cellichamen, gliacellen en andere celtypen. Derhalve dergelijke analyses moeten worden gecombineerd met beeldvormende technieken die de subcellulaire lokalisatie van mRNA te bevestigen. RNA in situ hybridisatie (ISH RNA) maakt de detectie en visualisatie van specifieke RNA sequenties in cellen en weefsels. Echter, originele RNA ISH assays alleen geschikt voor de identificatie van zeer overvloedige RNAs 25, hetgeen zelden het geval axonally gelokaliseerde mRNA's. Voor de laatste decennia toenemende inspanningen hebben in het ontwikkelen van nieuwe technologieën die de detectie van mRNA mogelijk maken bij de single-molecule niveau gezet <sup> 25,26. Zo hebben Singer en collega ISH probes ontwikkeld om mRNA te detecteren in enkele cellen, bestaande uit 5 niet-overlappende fluorescent gelabelde 50-meren (voor details zie 27). Het belangrijkste verschil tussen de hierboven genoemde technieken en de hier beschreven dat de hoger gebruikt 20 double Z-structuur (lineair) probes die doorgaans gericht ~ 1 kb gebied van het RNA van belang te zorgen specificiteit en lage achtergrondniveaus. Probes worden vervolgens gehybridiseerd met voorversterker en versterker sequenties die uiteindelijk fluorescent gelabeld of geconjugeerd met chromogene enzymen die reacties mogelijk maken. Deze amplificatiestappen betere signaal-ruisverhouding vergeleken met andere technologieën ISH 28. Hier beschrijven we twee protocollen gebruiken RNAscope gecombineerd ofwel met fluorescentie immunocytochemie of met histologische kleurstoffen waardoor axonen tegenkleuring. Beide protocollen zijn geschikt om axonale lokalisatie van ATF4 mRNA in volwassen mo visualiserenGebruik en menselijke hersenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit rapport beschrijven we het gebruik van een hoge-resolutie ISH techniek voor de detectie van axonally gelokaliseerde ATF4 mRNA. Deze en eerdere gepubliceerde studies tonen aan dat deze technologie is compatibel met de antilichaam-gebaseerde eiwit detectie in weefsels of zelfs hele embryo 33. Belangrijk is onlangs gebruikt voor de detectie van mRNA in Arc dendrieten van hippocampale neuronen 34. Het kan ook worden gecombineerd met histologische kleurstoffen voor weefselkleuri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Alzheimer’s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer’s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions
Materials
| custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | In situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit – BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | In situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
Riferimenti
- Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
- Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
- Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
- Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
- Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
- Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
- Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
- Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
- Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
- Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
- Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
- Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
- Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
- Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
- Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
- Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
- Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
- Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
- Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
- Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
- Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and Practice of Histotechnology. , (1987).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
- Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
