Обнаружение Axonally локализованного мРНК в срезах мозга с помощью высоким разрешением<em> На месте</em> Гибридизация
Summary
RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.
Abstract
мРНК часто локализуется в позвоночных аксонов и их местный перевод требуется для поиска пути аксонов или разветвления в процессе разработки и технического обслуживания, ремонта или нейродегенеративных в postdevelopmental периодов. Высокие анализы пропускная недавно показали, что аксоны имеют более динамичное и сложное транскриптом, чем ожидалось ранее. Это анализ, однако, были в основном делается в культивируемых нейронах, где аксоны могут быть изолированы от сомато-дендритной отсеков. Это практически невозможно добиться такой изоляции в целых тканей в естественных условиях. Таким образом, для того, чтобы проверить набор мРНК и их функциональной значимости в целом животном, транскриптом анализ в идеале должны быть объединены с методами, которые позволяют визуализировать мРНК на месте. Недавно новые технологии ISH, которые обнаруживают РНК на уровне в одной молекулы были разработаны. Это особенно важно при анализе внутриклеточную локализацию мРНК, Так как локализованные РНК обычно находятся на низком уровне. Здесь мы описываем два протокола для обнаружения axonally-локализованных мРНК с использованием нового сверхчувствительного технологии РНК ISH. Мы объединили RNAscope ISH с аксонов контрастирующая с помощью флуоресцентной иммуногистохимии или гистологических красителей для проверки набор Atf4 мРНК для аксонов в естественных условиях в зрелом мозге мыши и человека.
Introduction
Аксонов набор мРНК и локальная перевод позволяют аксоны в ответ на внеклеточные стимулы в времени и пространстве острой манере 1. Intra-аксонов синтез белка лучше понимать в контексте развития нервной системы, где она играет решающую роль в росте поведения конуса 2-8, 9-11 аксона первопрохождения и ретроградной сигнализации 12,13. Но гораздо меньше известно о функциональном значении аксонов синтеза белка в нейронах после развития, когда аксонов мРНК и рибосом уровни значительно снижается 14,15. Зрелые позвоночных аксоны уже давно считается неактивным поступательно 16. Тем не менее, последние исследования показывают, что местное перевод активируется в зрелых аксонов при патологических условиях. Например, подмножество мРНК рекрутируется регенерации аксонов после травмы нерва и внутри аксонов синтез белка требуется для правильной регенерации аксонов этих 17. Кроме того, наша группа гас показали, что специфические мРНК набираются аксонов после локальное воздействие на заболевания пептида Альцгеймера Ар 1-42, и местного перевод фактора транскрипции ATF4 требуется для распространения нейродегенеративных последствий Ар 1-42 из аксонов нейронов сомы 18. Наконец, высокие анализы пропускная показали, что зрелые аксоны имеют более сложную и динамичную транскриптом, чем ожидалось 18-21, особенно при патологических состояниях. В свете этих исследований, высокую чувствительность и специфичность метода для выявления axonally локализованные мРНК в нервной системе взрослых не требуется.
Большая часть работы по набору мРНК и местного перевод в зрелых аксонов была выполнена на культивируемых нейронов. Это особенно верно для транскриптомный анализирует с специализированные методы культивирования, которые позволили изоляции аксонов от сомато-дендритной отсека 18-20. Хотя такие исследования дали ценные модулиIGHT в роли местного перевод в зрелых аксонов, вопрос о том, культивируемые нейроны добросовестно представлять ситуацию в естественных условиях, или если мРНК вербовка адаптивная реакция аксонов культивирования условиях остается открытым. Несколько исследований предоставили доказательства вербовки мРНК, чтобы созреть аксоны в естественных условиях. Например, транскрипт кодирующей обонятельной маркерного белка был обнаружен в аксонов в сенсорных нейронах взрослых 22. Трансген, содержащий 3 'UTR из β-актина мРНК транспортируется аксонов периферических и центральных нейронов нервной системы у мышей и локально переводится после развития периодов 23. Ламин b2 мРНК локализуется сетчатки аксонов в Xenopues Laevis головастиков и его истощение влияет обслуживание аксонов после аксонов развития 21. Вмешательство в аксонов транспорта мРНК, кодирующей для цитохром с оксидазы IV изменяет поведение мыши 24. Наконец, Atf4 мРНК находится во взрослой аXons мышей и человеческих мозгов в контексте Ар 1-42 индуцированной нейродегенерации 18.
Высокая пропускная способность анализа транскриптом оказались полезными для идентификации мРНК профили в изолированных аксонов в пробирке, но есть ограничения для естественных условиях исследования в так целыми тканей аксоны никогда не встречаются в изоляции, а перемешаны с нейронных клеточных тел, глиальные клетки и другие типы клеток. Таким образом, такой анализ должен быть объединен с методик визуализации, которые подтверждают внутриклеточную локализацию мРНК. РНК в гибридизация (ISH) РНК позволяет детектировать и визуализацию конкретных последовательностей РНК в клетках и тканях. Тем не менее, оригинальные анализы РНК ISH были пригодны только для идентификации весьма обильными РНК 25, который редко относится к axonally локализованных мРНК. За последние десятилетия все более активные усилия были введены в развивающихся новых технологий, которые позволяют обнаруживать мРНК при уровне одиночных молекул <suр> 25,26. Например, певица и ее коллеги разработали ISH зондов для обнаружения мРНК в одиночных камерах, состоящий в 5 неперекрывающихся флуоресцентно меченных 50-меров (подробнее см до 27). Основное различие между указанными выше методами и одного описанного здесь является то, что позже использует 20 двойной Z-структуру (не линейная) зонды, которые обычно воздействуют ~ 1 кб область РНК процентной обеспечивающей специфичности и низким уровнем фона. Затем зонды гибридизуют с предусилителем и усилителем последовательностей, которые, наконец, флуоресцентно меченых или сопряженных с ферментами, которые позволяют хромогенных реакций. Эти шаги усиления улучшить отношение сигнал-шум по сравнению с другими технологиями ISH 28. Здесь мы опишем два протокола, используя RNAscope сочетании либо с флуоресцентной иммуноцитохимии или гистологических красителей, позволяющих аксонов counterstaining. Оба протокола предназначены для визуализации аксонов локализации мРНК в Atf4 взрослых месиспользовать и мозги человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом докладе мы описываем использование технологии ISH высоким разрешением в обнаружении axonally локализованной Atf4 мРНК. Эти и предыдущие опубликованные исследования показывают, что эта технология совместима с на основе антител обнаружения белка в тканях или даже целые эмбрионов <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Alzheimer’s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer’s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions
Materials
| custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | In situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit – BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | In situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
Riferimenti
- Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
- Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
- Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
- Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
- Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
- Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
- Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
- Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
- Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
- Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
- Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
- Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
- Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
- Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
- Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
- Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
- Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
- Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
- Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
- Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
- Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and Practice of Histotechnology. , (1987).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
- Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
