Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA'larının Algılama<em> In Situ</em> Melezleme
Summary
RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.
Abstract
mRNA'ları sıkça omurgalı akson lokalize ve yerel çeviri akson yol bulma veya geliştirme sırasında ve postdevelopmental dönemlerde bakım, onarım veya nörodejenerasyonun için dallanma için gereklidir. Yüksek verim analizleri son zamanlarda aksonlar önce beklenenden daha dinamik ve karmaşık transcriptome sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bu analiz, bununla birlikte daha çok aksonlar somato-dendritik bölmeleri izole edilebilir kültürlenmiş nöronlar yapılmıştır. Bu, in vivo olarak, tüm dokularda bu tür izolasyon elde etmek hemen hemen imkansızdır. Bu durumda, bir bütün hayvan mRNA ve bunların fonksiyonel alaka işe doğrulamak amacıyla, transcriptome analizleri ideal yerinde mRNA görülmesini sağlayacak teknikleri ile kombine edilmelidir. Son zamanlarda, bir tek-molekül düzeyinde RNA'lar tespit roman ISH teknolojileri geliştirilmiştir. MRNA'nın hücre içi lokalizasyonu analiz edilirken bu özellikle önemlidirBeri lokalize RNA'lar genellikle düşük seviyelerde bulunur. Burada yeni bir derece hassas bir RNA ISH teknolojisini kullanarak axonally-lokalize mRNA'ların tespiti için iki protokol açıklar. Biz olgun fare ve insan beyinlerinde in vivo akson için Atf4 mRNA işe doğrulamak için floresan immunhistokimya veya histolojik boyalar kullanarak aksonal counterstain ile RNAscope ISH birleştirdik.
Introduction
Aksonal mRNA istihdam ve yerel çeviri bir zamansal ve mekansal akut bir şekilde 1 ekstrasellüler uyaranlara yanıt vermek için aksonları etkinleştirin. Intra-aksonal protein sentezi en iyi akson 9-11 pathfinding ve retrograd 12,13 sinyalizasyon, büyüme konisi davranış 2-8 yılında çok önemli roller oynamaktadır nörogelişimsel bağlamında anlaşılmaktadır. Aksonal mRNA ve ribozom seviyeleri büyük ölçüde 14,15 azalır Ama çok daha az post-gelişimsel nöronlar akson protein sentezi fonksiyonel önemi hakkında bilinmektedir. Olgun omurgalı aksonlar uzunluğunda 16 translationally inaktif olduğu düşünülmektedir. Ancak son çalışmalar, yerel çeviri patolojik koşullarda olgun aksonların içinde yeniden olduğunu göstermektedir. Örneğin, mRNA bir alt sinir yaralanması ve intra-aksonal protein sentezi, bu aksonlar 17 doğru rejenerasyonu için gerekli olan aşağıdaki yenileyici aksonlar için işe. Ayrıca, bizim grup haS, Alzheimer hastalığı peptid Aβ 1-42 ve transkripsiyon faktör ATF4 lokal çeviri yerel nöronal soma 18 aksonlardan Aβ 1-42 nörodejeneratif etkileri yaymak için gereklidir sonra spesifik mRNA'lar aksonlar için işe olduğunu göstermiştir. Son olarak, yüksek verimlilik analizleri olgun aksonlar özellikle patolojik koşullarda, 18-21 beklenenden daha karmaşık ve dinamik bir transcriptome sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bu çalışmalar ışığında, son derece hassas ve özel yöntem, yetişkin sinir sisteminde lokalize axonally mRNA'lar tabi tespit etmek.
MRNA işe ve olgun akson yerel çeviriye çalışmaların çoğu kültürlü nöronlar üzerinde yapılmıştır. Özel kültür yöntemleri somato-dendritik bölmesi 18-20 den akson izolasyonu izin vermesini var çünkü transcriptome analizleri için bu özellikle doğrudur. Bu tür çalışmalar, değerli ins verilmiş olmasına rağmenolgun akson yerel çeviri rolüne ight, soru kültürlü nöronlar sadakatle vivo durumu temsil veya mRNA işe kültürleme koşullara aksonların bir uyum cevabı ise hala açık olup olmadığını. Az sayıda çalışma in vivo aksonlar olgun mRNA işe kanıtlar sağlamıştır. Örneğin, koku markör proteini kodlayan transkript yetişkin duyu nöronları 22 akson tespit edildi. Β-aktin mRNA 'nın 3' UTR içeren bir transgen farelerinde periferal ve merkezi sinir sistemi nöronlarının akson taşınır ve yerel olarak gelişim dönemlerde 23 sonra çevrilmiştir. Xenopues Kurbağa yavrularını laevis de Lamin b2 mRNA retina aksonlar lokalize ve tükenme aksonal gelişimi 21 sonra akson bakım etkiler. Sitokrom C oksidaz IV mRNA kodlama aksonal taşıma Müdahale fare davranışını 24 değiştirir. Son olarak, Atf4 mRNA yetişkin a bulunanAβ 1-42 bağlamında fare ve insan beyin Xons nörodejenerasyonu 18 indüklenen.
Yüksek üretim transcriptome analizleri, in vitro olarak izole akson mRNA profillerini belirlemek ancak aksonlar izolasyon bulunabilir, ancak nöronal hücre gövdeleri, gliyal hücreleri ve diğer hücre tipleri ile iç içe hiçbir zaman bütün dokularda yana in vivo çalışmalar için sınırlamalar olması yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu durumda, bu analizler, mRNA bir hücre içi lokalizasyonu teyit görüntüleme teknikleri ile kombine edilmelidir. In situ hibridizasyon (ISH RNA) RNA hücre ve dokularda spesifik RNA dizilerinin algılama ve görselleştirme sağlar. Ancak, orijinal RNA, ISH testlerinin nadiren axonally lokalize mRNA için durum oldukça zengin RNA'ların 25 tanımlanması için uygun idi. Çabaları artan son yıllarda için tek-molekül düzeyinde mRNA algılanmasına izin gelişen yeni teknolojiler konulmuştur <sup> 25,26. Örneğin, Singer ve arkadaşları içinde oluşan tek hücrelerde mRNA algılamak için ISH sondalar geliştirdik 5 örtüşmeyen floresan (ayrıntılar 27'ye bakınız için) 50-mers etiketli. Yukarıda belirtilen teknikler ve burada açıklanan bir arasındaki temel fark, daha sonra 20 çift Z-yapı (lineer değil), tipik olarak, faiz sağlanması özgüllük ve düşük arka plan seviyelerinin RNA ~ 1 kb bölgesini hedef sondalar kullanmasıdır. Sondalar daha sonra son olarak, flüoresan olarak etiketlenir veya kromojenik tepkileri izin enzimler ile konjuge edilmiş ön yükselteç ve amplifikatör sekansları ile hibridize edilir. Bu amplifikasyon adımları diğer ISH teknolojileri 28 ile karşılaştırıldığında sinyali-gürültü oranını iyileştirir. Burada floresans immunositokimya ile veya aksonal counterstaining sağlayan histolojik boyalarla, ya Birleştirilen RNAscope kullanılarak iki protokol açıklar. Her iki protokol erişkin mo Atf4 mRNA aksonal lokalizasyonu görselleştirmek için uygundurkullanımı ve insan beyni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda axonally lokalize Atf4 mRNA'nın tespiti yüksek çözünürlüklü ISH teknolojisinin kullanımını tarif eder. Bu ve daha önce yayınlanmış çalışmalar, bu teknoloji dokular ya da hatta tüm embriyolar 33 antikor bazlı protein tespiti ile uyumlu olduğunu gösterir. Önemli olarak, bu son hipokampal nöronlar 34 dendritleri olan ark mRNA'nın tespiti için kullanılmıştır. Aynı zamanda, dokuya boyama için histolojik boyalar ile kombine edilebilir. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Alzheimer’s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer’s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions
Materials
| custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | In situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit – BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | In situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
Riferimenti
- Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
- Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
- Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
- Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
- Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
- Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
- Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
- Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
- Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
- Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
- Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
- Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
- Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
- Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
- Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
- Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
- Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
- Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
- Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
- Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
- Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and Practice of Histotechnology. , (1987).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
- Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
