Administration intranasale de vaccins contre la grippe recombinant chimérique dans les modèles de souris pour étudier l'immunité muqueuse
Summary
There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.
Abstract
Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies.
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.
Introduction
La génération de la mémoire immunologique en l'absence de la maladie est la base physiologique de vaccination efficace 1. Récemment, les approches fondées sur la biologie des systèmes ont révélé que les vaccins à succès tels que le vaccin contre la fièvre jaune, induisent une forte induction de réponses immunitaires innées et l'activation de plusieurs sous-ensembles de cellules dendritiques (CD), qui à son tour, conduit à multilignée activation de l'antigène Les cellules T spécifiques 2,3. Depuis les PED sont la seule population de cellules immunitaires avec la possibilité d'activer les cellules T naïves spécifiques de l'antigène 4, l'étude de leur fonction lors de la vaccination est essentielle pour comprendre les réponses immunitaires aux vaccins et de concevoir des stratégies futures contre les agents pathogènes difficiles.
Un système permettant le traçage des différents sous-ensembles PED au cours des réponses immunitaires aux vaccins serait souhaitable afin d'établir une cinétique précis de la migration vers les tissus lymphoïdes DC, et donc de fournircomprendre les mécanismes physiologiques responsables du déclenchement de l'immunité adaptative spécifique vaccin. La génétique inverse à base approches offrent la possibilité de générer modifié, les vaccins vivants atténués qui peuvent être utilisés expérimentalement avec ce but. Depuis sa mise en œuvre sur la recherche sur la grippe, la génétique inverse à base de plasmides a été largement employé pour générer des souches grippales recombinantes dont LAIVs. Les protocoles standard pour sauver virus grippaux recombinants exigent multi-transfection de lignées très transfectables de cellules avec des plasmides de ambisens (produisant à la fois de l'ARN sens positif et négatif) contenant les huit grippe segments viraux ainsi que l'amplification dans un système permissif comme Madin-Darby de rein de chien ( MDCK) et / ou des oeufs embryonnés de poulet 5. Cependant, l'application de la génétique inverse pour générer des outils moléculaires pour étudier les mécanismes immunitaires de la vaccination demeure inexploré.
La générationde nouveaux modèles de souris permettant raréfaction spécifique de sous-ensembles de cellules immunitaires, y compris les pays en développement, a ouvert de nouvelles possibilités de comprendre les mécanismes immunitaires de base qui sous-tendent la protection vaccinale-induite. La comparaison entre les fonctions de sous-ensembles DC chez les souris et les humains a révélé que, dans une grande mesure, la souris et CD humaines sont fonctionnellement homologue 6,7, ces résultats suggèrent fortement que le développement de modèles de souris permettant raréfaction spécifique des PED à l'état stationnaire et dans des conditions inflammatoires, peuvent servir à comprendre la physiologie des réponses DC chez les humains. Ces dernières années, un certain nombre de modèles de souris a été générée portant des transgènes exprimant le récepteur de la toxine diphtérique simien (DT) (DTR) sous le contrôle de la région promotrice d'un gène d'intérêt 8,9. Depuis tissus de souris ne expriment naturellement DTR, ces modèles permettent appauvrissement conditionnelle de sous-ensembles de cellules portant le gène ciblé d'intérêt lors de l'inoculation de la souris avec DT. Ainsi, notre ability à épuiser les DC spécifiques et d'autres leucocytes in vivo au cours de processus physiologiques, a été grandement améliorée par la mise au point sur la base de ro-DTR. Cependant, bien que ces modèles de souris transgéniques ont été largement utilisés pour comprendre l'ontogenèse du système immunitaire, leur application au développement d'un vaccin a été testé à peine. Ici, en combinant grippe génétique inverse et de chimères de moelle osseuse compétitifs basés DTR, nous proposons une méthode pour étudier la cinétique de l'immunité du vaccin ainsi que la fonction individuelle de gènes au cours des réponses immunitaires aux vaccins in vivo. L'application de cette technologie pour l'évaluation préclinique de nouveaux vaccins contre les maladies infectieuses difficiles pourrait aider à rationaliser la conception de vaccins et de tester des vaccins candidats in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous décrivons comment la génétique et des modèles de souris chimériques inverse peut être utilisé pour élucider les mécanismes physiologiques et moléculaires de l'immunité induite par le vaccin. La génétique de la grippe inverse est établi dans de nombreux laboratoires et a joué un rôle principal dans la compréhension de la grippe pathogenèse, la réplication et la transmission 17. Un point clé dans notre protocole est le sauvetage des vaccins antigrippaux adaptés a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sergio Gómez-Medina for excellent technical support with mouse experiments. This work was supported by funds from the Leibniz Association and the Leibniz Center of Infection. A.L. is a recipient of a pre-doctoral fellowship from the Leibniz Graduate School.
Materials
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1X) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| Opti MEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1X) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
Riferimenti
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