Интраназального введения рекомбинантного гриппа вакцин в химерных мышей Модели для изучения слизистых оболочек
Summary
There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.
Abstract
Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies.
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.
Introduction
Поколение иммунологической памяти в отсутствии заболевания физиологическая основа эффективного вакцинации 1. Недавно системной биологии подходы показали, что успешные вакцины, такие как вакцины против желтой лихорадки, индуцируют сильную индукцию врожденных иммунных реакций и активации нескольких подмножеств дендритных клеток (ДК), который, в свою очередь, приводит к активации мультилинейной антиген специфическими Т-клетками 2,3. Так ДК являются только иммунная клетка населения с возможностью активировать антиген-специфичные наивные Т-клетки 4, изучение их функции во время вакцинации важно понять иммунные ответы на вакцины и разрабатывать будущие стратегии в отношении сложных патогенов.
Система позволяет трассировку различных подмножеств ДК во время иммунных реакций на вакцины хочется, чтобы установить точные кинетики миграции DC в лимфоидных тканях, и, следовательно, для обеспеченияпонимание физиологических механизмов, ответственных за инициацию вакцины конкретных адаптивного иммунитета. Обратной генетики подходы предлагают возможность генерировать изменены, живые ослабленные вакцины-которые могут быть использованы экспериментально с этой целью. С момента своего внедрения на исследования гриппа, плазмиды на основе обратной генетики была широко используется для создания рекомбинантных штаммов гриппа, включая LAIVs. Стандартные протоколы, чтобы спасти рекомбинантные вирусы гриппа требуют мульти-трансфекции высоко transfectable клеточных линий ambisense плазмид (производящих как положительный и отрицательный смысл РНК), содержащих восемь вируса гриппа сегменты, а также усиления в разрешительной системе, таких как Madin-Darby почки собаки ( MDCK клетки) и / или куриные яйца куриного эмбриона 5. Тем не менее, применение обратной генетики для получения молекулярных инструментов для изучения иммунных механизмов вакцинации остается неисследованной.
Поколениеновых моделей, позволяющих мыши определенный истощение иммунной подмножеств клеток, в том числе ДК, открыла новые возможности для понимания основных иммунных механизмов, лежащих защиту вакциной вызвало. Сравнение функций постоянного тока подмножества у мышей и человека показали, что, в значительной степени, мышь и человека ДК функционально гомологичны 6,7, эти данные, убедительно свидетельствуют, что разработка моделей мыши позволяет конкретный истощение домена в стационарном состоянии и при воспалительных условиях, может служить, чтобы понять физиологию ответов постоянного тока в организме человека. В последние годы ряд моделей мыши были получены проведения трансгены, выражающие обезьян дифтерийный токсин (ДТ) рецептор (DTR) под контролем промоторной области гена процентной 8,9. Так тканей мыши, естественно, не выразить DTR, эти модели позволяют условный истощение клеток подмножеств несущих целевой ген интереса при мыши прививки с DT. Таким образом, наша Abiliти истощать конкретные контроллеры домена и другие лейкоциты в естественных условиях в течение физиологических процессов, была значительно улучшена по развитию DTR-ро основе. Однако, хотя эти трансгенные мышиные модели широко используются для понимания онтогенеза иммунной системы, их применение в разработке вакцин была едва испытания. Здесь, сочетая гриппа обратной генетики и конкурентные химеры костного мозга DTR-основанные, мы предлагаем метод изучения кинетики иммунитета вакцин, а также отдельной функции гена во иммунных реакций на вакцины в естественных условиях. Применение этой технологии для доклинических оценки новых вакцин против инфекционных заболеваний сложных могло бы способствовать рационализации дизайн вакцин и проверить кандидатов вакцины в естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы рассмотрим, как генетика и химерные мышиные модели могут быть использованы для выяснения физиологических и молекулярных механизмов иммунитета, вызванного вакциной. Грипп обратной генетики устанавливается во многих лабораториях и сыграл главную роль в пониман?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sergio Gómez-Medina for excellent technical support with mouse experiments. This work was supported by funds from the Leibniz Association and the Leibniz Center of Infection. A.L. is a recipient of a pre-doctoral fellowship from the Leibniz Graduate School.
Materials
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1X) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| Opti MEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1X) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
Riferimenti
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
