Intranasal administration av rekombinant influensavacciner i chimär musmodeller för att studera slemhinneimmunitet
Summary
There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.
Abstract
Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies.
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.
Introduction
Genereringen av immunologiskt minne i frånvaro av sjukdom är den fysiologiska grunden för effektiv vaccinering 1. Nyligen har systembiologi baserade metoder visat att framgångsrika vacciner såsom vaccin mot gula febern, framkalla en stark induktion av medfödda immunsvar och aktivering av flera undergrupper av dendritiska celler (DC), vilket i sin tur leder till multilineage aktivering av antigen- specifika T-celler 2,3. Eftersom DC är den enda immuncellpopulation med förmåga att aktivera antigenspecifika naiva T-celler 4, är studiet av deras funktion under vaccination viktigt att förstå immunsvar mot vaccin och att utforma framtida strategier mot utmanande patogener.
Ett system som möjliggör spårning av olika DCS grupper under immunsvar mot vaccin skulle vara önskvärt för att fastställa en korrekt kinetik DC migration till lymfoidvävnader, och därför att tillhandahållainsikt i de fysiologiska mekanismer som ansvarar för initiering av vaccinspecifik adaptiv immunitet. Omvänd genetik baserade strategier erbjuder möjligheten att generera modifierade, levande försvagade vacciner som kan användas experimentellt med detta syfte. Sedan dess genomförande på forskning influensa, har plasmid-baserad omvänd genetik i stor utsträckning användas för att generera rekombinanta influensastammar inklusive LAIVs. Standardprotokoll för att rädda rekombinanta influensavirus kräver flera transfektion av mycket transfekterbara cellinjer med ambisense plasmider (producerar både positiva och negativa RNA) innehållande åtta influensa virala segment samt förstärkning i en tillåtande system såsom Madin-Darby Canine Kidney ( MDCK) celler och / eller kyckling embryone ägg 5. Förblir dock tillämpningen av omvänd genetik att skapa molekylära verktyg för att studera immunmekanismerna vaccination outforskade.
Alstringennya musmodeller möjliggör specifik utarmning av immuncellundergrupper, inklusive utvecklingsländerna, har öppnat nya möjligheter att förstå de grundläggande immun mekanismerna bakom vaccin framkallade skydd. Jämförelsen mellan DC delmängd funktioner hos möss och människor har visat att, i stor utsträckning, mus och mänskliga utvecklingsländerna är funktionellt homolog 6,7, dessa fynd starkt tyder på att utvecklingen av musmodeller tillåter specifik utarmning av DC i steady state och under inflammatoriska tillstånd, kan tjäna till att förstå fysiologin hos DC responser hos människor. Under de senaste åren har ett antal musmodeller har genererats som bär transgener som uttrycker simian difteritoxin (DT) receptor (DTR) under kontroll av promotorregionen av en gen av intresse 8,9. Eftersom musvävnader inte naturligt uttrycker DTR, dessa modeller tillåter villkorlig utarmning av cellgrupper bär riktade genen av intresse på mus ympning med DT. Således vår ability att tömma särskilda utvecklingsländerna och andra leukocyter in vivo under fysiologiska processer, har förbättrats avsevärt genom utvecklingen av DTR-baserade ro. Men även om dessa transgena musmodeller har använts i stor utsträckning för att förstå ontogenin av immunsystemet, deras tillämpning på vaccinutveckling har knappt testat. Här, genom att kombinera influensa omvänd genetik och DTR-baserade konkurrenskraftiga benmärgs chimärer, föreslår vi en metod för att studera kinetiken vaccin immunitet såväl som enskilda geners funktion under immunsvar på vacciner in vivo. Tillämpningen av denna teknik för preklinisk utvärdering av nya vacciner mot utmanande infektionssjukdomar kan bidra till att rationalisera vaccin design och testa vaccinkandidater in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie beskriver vi hur omvänd genetik och chimära musmodeller kan utnyttjas för att belysa de fysiologiska och molekylära mekanismer av vaccin-inducerad immunitet. Influensa omvänd genetik är etablerad i många laboratorier och har spelat en chefsroll i att förstå influensa patogenes, replikering och överföring 17. En viktig punkt i våra protokoll är rädda vacciner kall anpassad influensa som uttrycker främmande epitoper. Även strategin att införa korta cDNA i stjälken av neuraminida…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sergio Gómez-Medina for excellent technical support with mouse experiments. This work was supported by funds from the Leibniz Association and the Leibniz Center of Infection. A.L. is a recipient of a pre-doctoral fellowship from the Leibniz Graduate School.
Materials
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1X) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| Opti MEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1X) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
Riferimenti
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
