Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak
Summary
There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.
Abstract
Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies.
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.
Introduction
hastalığın yokluğunda immünolojik bellek üretimi etkili bir aşı 1 fizyolojik temelidir. Son zamanlarda, sistem biyolojisi-bazlı yaklaşımlar, sarı humma aşı olarak başarılı bir şekilde aşılar, sırayla, kurşun antijen aktivasyonunu multilineage doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin ve dendritik hücreler (DC), birkaç alt takımından aktivasyon kuvvetli bir uyarımının neden olduğunu ortaya koymuştur Belirli T hücreleri 2,3. DH'ler, antijene özel T hücrelerinin naif 4 aktive etme kabiliyetine sahip, sadece bağışık hücre popülasyonu olduğu için, aşılama sırasında fonksiyonunun çalışması aşılara bağışıklık tepkilerini anlamak ve zorlu patojenlere karşı gelecek stratejilerini tasarımı için çok önemlidir.
Aşılara bağışıklık tepkilerinin sırasında farklı DCler alt kümelerinin izleme sağlayan bir sistem sağlamaktır, bu nedenle lenfoid dokulara DC göç doğru bir kinetik oluşturulması için arzu edilebilir, ve olurAşı özgü adaptif bağışıklık başlatılmasından sorumlu fizyolojik mekanizmaların içgörü. Genetik temelli Ters yaklaşımlar, olasılık modifiye oluşturmak için bu amaçla deneysel kullanılabilecek canlı zayıflatılmış aşılar sunuyoruz. İnfluenza araştırma uygulanması için, plazmid bazlı ters genetik yaygın LAIVs de dahil olmak üzere rekombinant influenza suşları oluşturmak için kullanılmıştır. Standart protokolleri (rekombinant influenza virüsleri gibi Madin-Darby köpek böbrek gibi hoşgörülü sistemde yükseltilmesi yanı sıra sekiz grip viral segmentleri içeren ambisens plazmid ile son derece transfectable hücre hatları (pozitif ve negatif anlamda RNA hem üreten) multi-transfeksiyonunu gerektiren kurtarmak için MDCK) hücreleri ve / veya tavuk embriyo haline getirilmiş yumurtalar 5. Bununla birlikte, aşı, bağışıklık mekanizmaları incelemek amacıyla moleküler araçlar üretmek için ters genetik uygulama keşfedilmemiştir.
nesilDC'lerle dahil bağışıklık hücre alt, spesifik tükenmesi izin yeni fare modellerinin, aşı tetiklenen koruma altında yatan temel bağışıklık mekanizmaları anlamak için yeni olanaklar açtı. farelerde ve insanlarda DC alt fonksiyonları arasında karşılaştırması büyük ölçüde, fare ve insan DH'leri güçlü, homolog işlevsel bu bulgular 6,7 olan fare modellerinin geliştirilmesi kararlı halde DC'lerin belirli bir tükenmesi izin düşündürmektedir ortaya koymuştur ve iltihaplı koşullar sırasında, insanlarda DC tepkilerinin fizyolojisini anlamak için hizmet edebilir. Son yıllarda, fare modelleri bir kaç İlgi 8,9 arasında bir genin promotör bölgesinin kontrolü altında simian difteri toksini (DT) reseptörü (DTR) eksprese eden transgenler taşıyan üretilmiştir. Fare dokuları doğal DTR ifade olmadığından, bu modeller DT ile fare inokülasyon üzerine ilgi hedeflenen genini taşıyan hücre alt koşullu tükenmesi izin verir. Böylece, abilifizyolojik işlemler sırasında in vivo özel DCler ve diğer lökosit tüketmek ty, büyük DTR-tabanlı ro gelişmesi ile geliştirilmiştir. Bu transgenik fare modelleri, immün sistemin ontogenezini anlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır ancak bununla birlikte, aşı gelişimi için uygulama pek test edilmiştir. Burada, grip ters genetik ve DTR-temelli rekabet kemik iliği kimeralar birleştirerek, biz in vivo aşılara bağışıklık yanıtları sırasında aşı bağışıklık yanı sıra bireysel gen fonksiyonu kinetiğini incelemek için bir yöntem öneriyoruz. zorlu bulaşıcı hastalıklara karşı yeni aşıların klinik öncesi değerlendirilmesi için bu teknolojinin uygulama aşı tasarımı rasyonalize etmek ve in vivo aşı adayları test etmeye yardımcı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, aşıyla indüklenen bağışıklık fizyolojik ve moleküler mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabilir kadar karşıt genetik ve kimerik fare modelleri açıklanmaktadır. Grip ters genetik birçok laboratuvarda kurulan ve grip patogenezi, çoğaltma ve iletim 17 anlamada bir baş rol oynamıştır. Bizim protokolde önemli bir nokta, yabancı epitopları ifade soğuk uyarlanmış influenza aşılarının kurtarma olduğunu. Nöraminidaz sap içinde kısa cDNA'ları sokulması st…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sergio Gómez-Medina for excellent technical support with mouse experiments. This work was supported by funds from the Leibniz Association and the Leibniz Center of Infection. A.L. is a recipient of a pre-doctoral fellowship from the Leibniz Graduate School.
Materials
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1X) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| Opti MEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1X) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
Riferimenti
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
