Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per l'infusione diretta stereotassica cerebrale di amiloide-beta. Questa metodologia fornisce un modello murino alternativo in vivo per affrontare gli effetti a breve termine dell'amiloide-beta sui neuroni cerebrali.

Abstract

Malattia di Alzheimer è una malattia neurodegenerativa che colpisce la popolazione. Una caratteristica neuropathological fondamentale della malattia è l'eccessiva produzione di beta-amiloide e la deposizione di beta-amiloide placche nelle regioni del cervello degli individui afflitti. Nel corso degli anni gli scienziati hanno generato numerosi modelli del mouse della malattia di Alzheimer che tentano di replicare il beta-amiloide patologia. Purtroppo, i modelli di topo solo selettivamente imitano le caratteristiche della malattia. La morte neuronale, un effetto importante nel cervello dei pazienti con malattia di Alzheimer, è notevolmente carente in questi topi. Quindi, noi ed altri abbiamo impiegato un metodo di infondere direttamente solubili specie oligomeriche di beta-amiloide - forme di beta-amiloide, che hanno dimostrato di essere più tossico per i neuroni - stereotaxically nel cervello. In questo rapporto utilizziamo maschi C57BL / 6J per documentare questa tecnica chirurgica di aumentare i livelli di beta-amiloide in una selezione regione del cervello. Ilbersaglio infusione è il giro dentato dell'ippocampo perché questa struttura cerebrale, insieme al proencefalo basale che è collegata dal circuito colinergico, rappresenta una delle aree di degenerazione nella malattia. I risultati di elevare beta-amiloide nel giro dentato tramite infusione stereotassica rivelano aumenti di perdita di neuroni nel giro dentato entro 1 settimana, mentre vi è un concomitante aumento della morte cellulare e la perdita di neuroni colinergici nel ramo verticale della banda diagonale di Broca del proencefalo basale. Questi effetti sono stati osservati fino a 2 settimane. I nostri dati suggeriscono che il beta-amiloide modello infusione attuale prevede un modello alternativo del mouse per affrontare regione specifica morte dei neuroni in una base a breve termine. Il vantaggio di questo modello è che amiloide-beta può essere elevato in modo spaziale e temporale.

Introduction

Depositi di placca amiloide, che sono composti di beta-amiloide (A? _1-42), sono un elemento chiave della patologia della malattia di Alzheimer (AD). Numerosi studi hanno dimostrato che i livelli elevati o tossici di ricombinante oligomeri Ap _1-42 suscitare morte neuronale, sinaptica la distrofia, perdita e disfunzioni; così come apprendimento e memoria deficit ^1-4. Regioni cerebrali colpite sono l'ippocampo, la corteccia, e le strutture sottocorticali, come prosencefalo basale e il ^5,6 amigdala. Ad oggi, ci sono più modelli di topi transgenici che tentano di simulare l'Ap _1-42 patologia di AD. A seconda d....

Protocol

Nota: Per tutti sperimentazione animale, istituzionale e le linee guida nazionali per la cura e l'uso di animali da laboratorio sono stati seguiti.

1. Preparare Strumenti chirurgici e soluzioni per la chirurgia

1. Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici in acciaio inox.
2. Preparare 70% di etanolo diluendo 200 prova etanolo assoluto con grado molecolare acqua distillata deionizzata sterile.
3. Attaccare l'ago G 29 alla siringa Hamilton. Pulire l'interno della siringa Hamilton e l'ago attraverso l'elaborazione e l'acqua espulsione Nanopure ripetutamente per 1 min. Ripetere questa procedura c....

Results

L'attuale metodo di preparazione umana ricombinante oligomeric Ap _1-42 produce specie oligomeriche solubili costituiti da monomeri, dimeri, trimeri e tetrameri (Figura 1A). Questi a basso peso molecolare Ap _1-42 specie, ma non le fibrille e placche, sono state esposte in numerose impostazioni per essere più tossico per i neuroni ^1,4,9,17-19. Per determinare se oligomerica Ap _1-42 induce la morte dei neuroni nel cervello di topo Ap _1-42 (4 ml di 100 .......

Discussion

Per ottenere un successo Ap _1-42 iniezione lo sperimentatore o chirurgo deve: 1) utilizzare una tecnica asettica; 2) identificare correttamente la regione del cervello di interessi con coordinate precise; 3) essere in grado di rendere sicure le mouse nella telaio stereotassico con il cervello livellato sull'asse AP e ML; 4) avere la capacità di operare il micromanipolatore con precisione; 5) assicurare una corretta assistenza post-operatoria. Osservando tali passaggi chiave il mouse dovrebbe sopravvivere .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamina HCl (100 mg/ml)	Henry Schein Medical	1049007	100 mg di ketamina per 1 kg di
xilazina animale (20 mg/ml)	Henry Schein Medical	non disponibile	10 mg di xilazina per 1 kg di
buprenex (0,3 mg/ml)	Henry Schein Medical	1217793	0,1 mg di buprenex per 1 kg di
A&beta animale; 1-42	David Teplow/UCLA	non disponibile	100 μ M; Questa amiloide è stata utilizzata nell'articolo
Aβ 1-42	Bachem	H-1368	Può essere utilizzato al posto dell'amiloide dal laboratorio Teplow
Aβ 1-42	American Peptide	62-0-80B	Può essere utilizzato al posto dell'amiloide proveniente dal laboratorio Teplow
Scrambled Aβ 1-42	American Peptide	62-0-46B	Può essere utilizzato come peptide di controllo per confrontare Aβ 1-42
Anticorpo NU4 (anticorpo amiloide oligomerico)	Dono di William Klein/Northwestern U.	non disponibile	Diluizione 1:2.000
Anticorpo oligomerico anti-amiloide  (Coniglio policlonale)	EMD Millipore	AB9234	Può essere utilizzato al posto di Nu4; deve essere testato dall'utente finale
6E10 Anticorpo (topo monoclonale) (anticorpo amiloide)	Biolegend	sig-39320	Diluizione 1:1.000
Anticorpo ChAT (capra policlonale)	Millipore	AB144P	Diluizione 1:100
DeadEnd Sistema TUNEL fluorimetrico	Promega	G3250	Seguire le indicazioni del produttore per utilizzare
il reagente antisbiadimento Prolong Gold con DAPI	Invitrogen	P36935	Utilizzare quando si scivolano i vetrini
Fluorogold	Fluorochrome, LLC	non disponibile	soluzione al 2%
Etanolo assoluto (200 proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Per produrre etanolo al 70% per la sanificazione e la disinfezione del
gel di tricina Novex 10-20%	Life Technologies	EC6625BOX	Per separare Aβ 1-42
Novex Tricine SDS Running Buffer (10X)	Life Technologies	LC1675	Per l'esecuzione di gel di tricina al 10-20% Tampone
di trasferimento Novex Tris-glicina (25X)	Life Technologies	LC3675	Per il trasferimento di gel di tricina al 10-20% SuperSignal
Western Blot Enhancer	Thermo Scientific	46640	Per migliorare Aβ segnale 1-42; seguire il protocollo del produttore
Protran BA79 Membrana per tamponamento alla nitrocellulosa, 0,1 μ m	GE Healthcare Life Sciences	10402088	Per il trasferimento del 10-20% di gel di tricina
Xcell SureLock Mini-Cell	Life Technologies	EI0001	Elettroforesi aparato per l'esecuzione di gel di tricina al 10-20%
GenTeal Lubricant Eye Gel	Novartis	non disponibile	Per mantenere gli occhi del topo umidi durante l'intervento chirurgico; può essere trovato nei negozi di farmacia locale
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Refresh Optive Lubrificante Collirio	Allergan	non disponibile	Per mantenere umidi gli occhi del topo durante l'intervento chirurgico; può essere trovato nelle farmacie locali; Può essere utilizzato al posto di GenTeal
Betadine	Stoelting	50998	Per igienizzare e disinfettare
la spatola rotonda/conica.	VWR	82027-490	Per l'apertura della bocca di un animale
Bulldog Serrefines Clamps (Dim. ganascia 9X1,6 mm; Lunghezza 28 mm)	Strumenti per le scienze fini	18050-28	Opzionale; Per tenere la pelle del cuoio capelluto separata durante l'iniezione
Forbici dritte e fini (tagliente 25 mm; Lunghezza 11,5 cm)	Fine Science Tools	14060-11	Per tagliare il cuoio capelluto
#3 Manico per bisturi	Fine Science Tools	10003-12
#11 Lama chirurgica	Fine Science Tools	10011-00	Per eseguire l'incisione del cuoio capelluto
Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2,5x1,5 mm; Lunghezza 11,5 cm)	Fine Science Tools	91100-12	Per tenere chiuso il cuoio capelluto durante la sutura
Kit combinato rifinitore	Kent	Scientific CL9990-1201	Per la rasatura dei capelli
T/Pump Ricircolatore d'acqua calda	Kent Scientific	TP-700	Per riscaldare l'animale durante l'intervento chirurgico
Tappetino da guerra riutilizzabile (5" x 10")	Kent Scientific	TPZ-0510FEA	Per collegarlo al ricircolo dell'acqua calda T/Pump per riscaldare l'animale durante l'intervento chirurgico
Micro trapano a batteria	Stoelting	58610	Utilizzare frese in acciaio da 0,8 mm per praticare fori nel cranio
Strumento stereotassico standard da laboratorio con mouse e Adattatore per ratto neonatale	Stoelting	51615
Solo per lo strumento stereotassico del topo	Stoelting	51730	Può usarlo al posto di Stoelting Cat. #51615
Quintessential Stereotassico Iniettore	Stoelting	53311
Sterilizzatore per perline di vetro secco	Stoelting	50287	Per la sterilizzazione di strumenti in acciaio inossidabile
Telo chirurgico sterile (18 "x 26")	Stoelting	50981
Hamilton Siringa 50 ml, modello 705 RN SYR, NDL	Hamilton Company	7637-01	Per iniezione cerebrale; utilizzare siringhe diverse per soluzioni diverse
29 G Ago, mozzo piccolo RN NDL	Hamilton Company	7803-06	Per il collegamento alla siringa Hamilton per iniezione cerebrale
1 ml BD Siringhe per tubercolina	VWR	BD309659	Per la somministrazione di anestesia e soluzione salina
Ago da 30 g (0,5")	VWR	BD305106	Per la somministrazione di anestesia e soluzione salina
Bilancia elettronica portatile serie CS (Ohaus)	VWR	65500-202	Per pesare gli animali per determinare la dose di anestesia
Piastra riscaldante (Dim. piastra superiore 7,25x7,25 pollici)	VWR	47751-148	Per il riscaldamento degli animali dopo l'intervento chirurgico
Sutura in seta di seta Sofsilk Taglio C-1 3/8, 12 mm	Covidien	S1173	Per la chiusura della ferita
Vetbond Adesivo tissutale (3M)	Santa Cruz Biotechnology	sc-361931	Opzionale: per facilitare la chiusura della ferita; Utilizzare con sutura.
Applicatori sterili con stelo in legno con punta in cotone	Fisher scientific	22-029-488	Per la pulizia e l'asciugatura di ferite chirurgiche
Fisherbrand Superfrost Plus Vetrini per microscopio	Fisher Scientific	12-550-15	Per la raccolta di sezioni cerebrali
VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm	VWR	48393241	Per il montaggio di vetrini per microscopio
Thermo Scientific Nalgene Filtro per siringa 0,2 μ m	Fisher Scientific	194-2520	Per la sterilizzazione della soluzione salina
Marcatori cutanei sterili a doppia punta di Viscot Medical	Medline	VIS1422SRL91	Per la marcatura delle coordinate sul cranio