Inkapslings Thermogenic preadipocyter för transplantation till fettvävnad Depåer

Summary

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Abstract

Cellinkapsling har utvecklats för att innesluta viabla celler inom semipermeabla membran. De ympade inkapslade celler kan utbyta lågmolekylära metaboliter i vävnader från den behandlade värden för att uppnå långtidsöverlevnad. Det semipermeabla membranet tillåter inympade inkapslade celler för att undvika avstötning av immunsystemet. Inkapslingsförfarandet var utformad för att göra det möjligt för en kontrollerad frisättning av bioaktiva föreningar, såsom insulin, andra hormoner och cytokiner. Här beskriver vi en metod för inkapsling av katabola celler, som förbrukar lipider för värmeproduktion och energiupptagning (thermogenesis) i buken fettvävnad överviktiga möss. Inkapsling av termogena katabola celler kan vara potentiellt tillämplig på förebyggande och behandling av fetma och typ 2-diabetes. En annan potentiell tillämpning av katabola celler kan innefatta avgiftning från alkohol eller andra giftiga metaboliter och miljögifter.

Introduction

Ökad förekomst av kroniska sjukdomar ¹ har stimulerat studier på transplantation av terapeutiska cellpopulationer ^2. Syngena eller allogena stamceller är de vanligaste celltyper för dessa program ^2. Emellertid har dessa behandlingar inte möjliggöra kontroll av differentiering och migration av stamceller efter implantation och är inte kostnadseffektiv. Transplantation av genetiskt modifierade celler med nyttiga funktioner anar att förbättra behandlingen av många sjukdomar. Men genetiska cell modifieringar känns igen av värdens immunsystem, därför dessa behandlingar kräver immunsuppression ^3. Inkapsling av celler som producerar insulin har utvecklats av Dr Chang ^4. Tekniken bygger på inkapsling av celler i alginat droppar som är nedsänkta i en kalciumkloridlösning. Alginat molekyler består av mannuron (M) och guluronsyra (G) och kan anslutas genom Ca2 ⁺. Efter gelning pärlorna suspenderas en poly-L-lysin (PLL) lösning. Under detta steg binder PLL till G och M i alginat molekyler som upprättar kapseln membran. Porositeten hos kapselns membran kan moduleras genom att variera M- och PLL-koncentrationer, inkubationstiden och temperaturen. Bindningen av PLL beror också på typ och koncentration av alginat. Alginat matriser tvärbundna med Ca2 ⁺ joner, är instabila i den fysiologiska miljön eller i gemensamma buffertlösningar med hög koncentration av fosfat och citratjoner. Dessa buffertar kan extrahera Ca2 ⁺ från alginat och kondensera kärnan. Kondensering av alginat kärnan ger utrymme inuti kapslar för cellrörelse och tillväxt. Celler inkapslade i polyanjoniskt alginat med polykatjonisk poly-L-lysin (APL) är ogenomträngligt för immunoglobuliner men har tillströmningen av näringsämnen och utflöde av gifter. Dessa APL egenskaper gör det möjligt på lång sikt SUrvival av inkapslade celler efter transplantation in i genetiskt olika värdar. Elliott et al., Rapporterade överlevnad fungerande inkapslade porcina pankreatiska celler i en human patient nio år efter implantation ^5.

Inkapslingstekniker kan klassificeras i mikroinkapsling (3-800 um) och makroinkapsling (större än 1000 | im). Mikrokapslar är mer hållbara än makrokapslar ^6. Sedan dess upptäckt av Dr Chang och kollegor i 1964, har mikroinkapslingen använts i stor utsträckning för inkapsling av anabola celler som producerar insulin, andra hormoner och bioaktiva molekylerna ^7. Dessa behandlingar inför flera utmaningar i värdvävnaden, inklusive fibros och immunsvar ^8. Inledningsvis har biverkningar relaterade till kvaliteten på biopolymerer lösts. Men fortfarande initierar transplantation av anabola celler biverkningar, såsom fibros, som ett resultat av hormon overproduktion utanför en specialiserad körtel.

Under de senaste decennierna, fetma och typ 2-diabetes har nått epidemiska proportioner ^9. Mer än 30% av vuxna människor i världen är överviktiga och feta ^10. Ökad buken (IAB) fettbildning ökar förekomsten av kronisk inflammation och främjar typ 2-diabetes, hjärt- och kärlsjukdomar, vissa cancerformer och andra följdsjukdomar ^11-13. Flera bevislinjer föreslog att patogenesen i samband med IAB fett kan avvärjas genom särskilda adipocyter. Nyligen genomförda studier har visat att transplantation av subkutana adipocyter i IAB regionen kan förbättra metabolismen och minska fetma och insulinresistens hos gnagare di ^vivo-14. Effektiv minskning av övervikt och insulinresistens har associerats med termogena adipocyter kan avleda energi i form av värme ^15,16. Thermogenic modifiering av adipocyter kan uppnås genom stabil transfektiongener som deltar i mitokondriella protonfrånkoppling, såsom frånkoppling protein 1 (UCP1) eller gener som reglerar uttrycket av UCP1 och andra termogena gener ^15,16. Våra nya studier visade att brist på aldehyddehydrogenas 1 a1 (Aldh1a1) leder till termo ombyggnad av IAB fett som minskar övervikt och insulinresistens i dessa möss ^17,18. Notably inkapsling av termogen Aldh1a1 bristfällig (Aldh1a1 – / -) preadipocyter medierar samma terapeutiska effekt i IAB fett hos överviktiga möss av vildtyp, vilket tyder på nya terapeutiska möjligheter för behandling av IAB fett ^18. I experimentella inställningar, inkapslade celler gör det möjligt för forskare att studera effekter av specifika cellpopulationer på ett kostnadseffektivt sätt ^19. Här diskuterar vi metoden för inkapsling av en termogen katabolisk cellinjen och dess laboratorium och terapeutisk användning i en musmodell av fetma. Protokollet beskriver tRE faser för mikrokapselproduktion (figur 1): bildning av alginat mikropärlor (Figur 1A), bildandet av den polykatjoniska poly-L-lysin (PLL) membran på ytan av mikropärlor (Figur 1B), och avlägsnandet av den alginat kärnor (figur 1C).

Protocol

Studieprotokollet godkändes av Ohio State University etiska kommittéer. Djurförsök har godkänts av lACUC protokollet. Alla förfaranden genomfördes under den nivå 2 biosäkerhet skåp med laminärt flöde. Vi följde alla vanliga säkerhetskrav och förfaranden. Den mikroinkapslingsteknik för framställning av mikrokapslar har utförts såsom beskrivits 17, 18. 1. Förberedelser Material Bered 10 ml av 2% natriumalginatlösning i autoklaverad fysiologisk koksalt…

Representative Results

Figur 1 visar att varje steg av mikropärlor produktionen skulle kontrolleras under mikroskop. Figur 2A visar hur samodling adipocyter med ett monoskikt av inkapslade celler. Figur 2B är ett representativt exempel på en kvantitativ studie med fettceller / mikrokapslar samkulturer som beskrevs i avsnitt 5. Lysat av adipocyter analyserades med Western blöt. Inkapslade celler analyserades inte i detta experiment. Primär ATGL och β-aktin-antikroppar användes vid en 1:…

Discussion

Olika metoder har använts för att inkapsla celler, inklusive torkning, strängsprutning, och emulsionen ^19. I denna metod är de alginatpärlor strängsprutas genom en nål, beläggs sedan med PLL och alginatet kärnan skall upplösas för att fullborda inkapslingen. Även om denna metod har använts i flera år, är fortfarande utmanande bildning av pärlorna med den önskade storleken och sfärisk form. Storleken av kapslarna är mycket beroende på viskositeten hos natriumalginatlösning, extrudern diame…

Materials

Encapsulation device (VAR V1)	Nisco	LIN-0042	None
KD scientific syringe pump	KD scientific	780100Y	None
Olympus microscope	Olympus Optical	IX70-S8F2	None
Sodium alginate	Sigma	MKBP8122V	None
Poly-l-lysine hydrobromide (PLL)	Sigma	020M5006V	None
Calcium chloride	Sigma	SLBJ2662V	None
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma	030M0200	None
Sodium chloride	Sigma	SLBD2595V	None
Mini-PROTEAN TGX Gels	Bio-Rad	456-1093	None
ATGL primary antibody (from rabbit)	Cell Signaling	2138S	None
Secondary anti body (anti rabbit)	LI-COR	926-68071	None
Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer	Boston BioProducts	D25Y6Z	None
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	RNBD2893	None
Trypsin	Gibco	25200-056	None
Cortizone 10 anti-itch ointment	Cortizone 10	C4029138	None
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-092	None
Newborn calf serum (CS)	Sigma	N4762	None
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F4135	None
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma	I0516	None
Dexamethasone	Sigma	D4902	None
Insulin (bovine)	Sigma	I5879	None
Protease inhibitor cocktail tablets	Roche	4693159001	None