Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.
Cellinkapsling har utvecklats för att innesluta viabla celler inom semipermeabla membran. De ympade inkapslade celler kan utbyta lågmolekylära metaboliter i vävnader från den behandlade värden för att uppnå långtidsöverlevnad. Det semipermeabla membranet tillåter inympade inkapslade celler för att undvika avstötning av immunsystemet. Inkapslingsförfarandet var utformad för att göra det möjligt för en kontrollerad frisättning av bioaktiva föreningar, såsom insulin, andra hormoner och cytokiner. Här beskriver vi en metod för inkapsling av katabola celler, som förbrukar lipider för värmeproduktion och energiupptagning (thermogenesis) i buken fettvävnad överviktiga möss. Inkapsling av termogena katabola celler kan vara potentiellt tillämplig på förebyggande och behandling av fetma och typ 2-diabetes. En annan potentiell tillämpning av katabola celler kan innefatta avgiftning från alkohol eller andra giftiga metaboliter och miljögifter.
Ökad förekomst av kroniska sjukdomar 1 har stimulerat studier på transplantation av terapeutiska cellpopulationer 2. Syngena eller allogena stamceller är de vanligaste celltyper för dessa program 2. Emellertid har dessa behandlingar inte möjliggöra kontroll av differentiering och migration av stamceller efter implantation och är inte kostnadseffektiv. Transplantation av genetiskt modifierade celler med nyttiga funktioner anar att förbättra behandlingen av många sjukdomar. Men genetiska cell modifieringar känns igen av värdens immunsystem, därför dessa behandlingar kräver immunsuppression 3. Inkapsling av celler som producerar insulin har utvecklats av Dr Chang 4. Tekniken bygger på inkapsling av celler i alginat droppar som är nedsänkta i en kalciumkloridlösning. Alginat molekyler består av mannuron (M) och guluronsyra (G) och kan anslutas genom Ca2 +. Efter gelning pärlorna suspenderas en poly-L-lysin (PLL) lösning. Under detta steg binder PLL till G och M i alginat molekyler som upprättar kapseln membran. Porositeten hos kapselns membran kan moduleras genom att variera M- och PLL-koncentrationer, inkubationstiden och temperaturen. Bindningen av PLL beror också på typ och koncentration av alginat. Alginat matriser tvärbundna med Ca2 + joner, är instabila i den fysiologiska miljön eller i gemensamma buffertlösningar med hög koncentration av fosfat och citratjoner. Dessa buffertar kan extrahera Ca2 + från alginat och kondensera kärnan. Kondensering av alginat kärnan ger utrymme inuti kapslar för cellrörelse och tillväxt. Celler inkapslade i polyanjoniskt alginat med polykatjonisk poly-L-lysin (APL) är ogenomträngligt för immunoglobuliner men har tillströmningen av näringsämnen och utflöde av gifter. Dessa APL egenskaper gör det möjligt på lång sikt SUrvival av inkapslade celler efter transplantation in i genetiskt olika värdar. Elliott et al., Rapporterade överlevnad fungerande inkapslade porcina pankreatiska celler i en human patient nio år efter implantation 5.
Inkapslingstekniker kan klassificeras i mikroinkapsling (3-800 um) och makroinkapsling (större än 1000 | im). Mikrokapslar är mer hållbara än makrokapslar 6. Sedan dess upptäckt av Dr Chang och kollegor i 1964, har mikroinkapslingen använts i stor utsträckning för inkapsling av anabola celler som producerar insulin, andra hormoner och bioaktiva molekylerna 7. Dessa behandlingar inför flera utmaningar i värdvävnaden, inklusive fibros och immunsvar 8. Inledningsvis har biverkningar relaterade till kvaliteten på biopolymerer lösts. Men fortfarande initierar transplantation av anabola celler biverkningar, såsom fibros, som ett resultat av hormon overproduktion utanför en specialiserad körtel.
Under de senaste decennierna, fetma och typ 2-diabetes har nått epidemiska proportioner 9. Mer än 30% av vuxna människor i världen är överviktiga och feta 10. Ökad buken (IAB) fettbildning ökar förekomsten av kronisk inflammation och främjar typ 2-diabetes, hjärt- och kärlsjukdomar, vissa cancerformer och andra följdsjukdomar 11-13. Flera bevislinjer föreslog att patogenesen i samband med IAB fett kan avvärjas genom särskilda adipocyter. Nyligen genomförda studier har visat att transplantation av subkutana adipocyter i IAB regionen kan förbättra metabolismen och minska fetma och insulinresistens hos gnagare di vivo-14. Effektiv minskning av övervikt och insulinresistens har associerats med termogena adipocyter kan avleda energi i form av värme 15,16. Thermogenic modifiering av adipocyter kan uppnås genom stabil transfektiongener som deltar i mitokondriella protonfrånkoppling, såsom frånkoppling protein 1 (UCP1) eller gener som reglerar uttrycket av UCP1 och andra termogena gener 15,16. Våra nya studier visade att brist på aldehyddehydrogenas 1 a1 (Aldh1a1) leder till termo ombyggnad av IAB fett som minskar övervikt och insulinresistens i dessa möss 17,18. Notably inkapsling av termogen Aldh1a1 bristfällig (Aldh1a1 – / -) preadipocyter medierar samma terapeutiska effekt i IAB fett hos överviktiga möss av vildtyp, vilket tyder på nya terapeutiska möjligheter för behandling av IAB fett 18. I experimentella inställningar, inkapslade celler gör det möjligt för forskare att studera effekter av specifika cellpopulationer på ett kostnadseffektivt sätt 19. Här diskuterar vi metoden för inkapsling av en termogen katabolisk cellinjen och dess laboratorium och terapeutisk användning i en musmodell av fetma. Protokollet beskriver tRE faser för mikrokapselproduktion (figur 1): bildning av alginat mikropärlor (Figur 1A), bildandet av den polykatjoniska poly-L-lysin (PLL) membran på ytan av mikropärlor (Figur 1B), och avlägsnandet av den alginat kärnor (figur 1C).
Olika metoder har använts för att inkapsla celler, inklusive torkning, strängsprutning, och emulsionen 19. I denna metod är de alginatpärlor strängsprutas genom en nål, beläggs sedan med PLL och alginatet kärnan skall upplösas för att fullborda inkapslingen. Även om denna metod har använts i flera år, är fortfarande utmanande bildning av pärlorna med den önskade storleken och sfärisk form. Storleken av kapslarna är mycket beroende på viskositeten hos natriumalginatlösning, extrudern diame…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Jennifer Petrosino och David DiSilvestro för redaktionell hjälp. Denna forskning stöds av Award nummer 20020728 från American Egg Board och Award nummer 10040042 från Novo Nordisk Pharmaceuticals samt av Food Innovation Center, Byrån för internationella ärenden, Center for Advanced Functional Foods forskning och entreprenörskap vid OSU samt National Science Foundation bevilja EEG-0914790 (LJL). Projektet beskrivs stöddes av Award Antal R21OD017244 (OZ) och UL1RR025755 (OSUCCC) från National Center for Research Resources, som finansieras av ämbetsperioden för direktören, National Institutes of Health (OD) och stöds av NIH färdplanen för medicinsk forskning och NCI P30CA16058. Innehållet är ensamt ansvar författarnas egna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Center for Research Resources eller National Institutes of Health.
Encapsulation device (VAR V1) | Nisco | LIN-0042 | None |
KD scientific syringe pump | KD scientific | 780100Y | None |
Olympus microscope | Olympus Optical | IX70-S8F2 | None |
Sodium alginate | Sigma | MKBP8122V | None |
Poly-l-lysine hydrobromide (PLL) | Sigma | 020M5006V | None |
Calcium chloride | Sigma | SLBJ2662V | None |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 030M0200 | None |
Sodium chloride | Sigma | SLBD2595V | None |
Mini-PROTEAN TGX Gels | Bio-Rad | 456-1093 | None |
ATGL primary antibody (from rabbit) | Cell Signaling | 2138S | None |
Secondary anti body (anti rabbit) | LI-COR | 926-68071 | None |
Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer | Boston BioProducts | D25Y6Z | None |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | RNBD2893 | None |
Trypsin | Gibco | 25200-056 | None |
Cortizone 10 anti-itch ointment | Cortizone 10 | C4029138 | None |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | None |
Newborn calf serum (CS) | Sigma | N4762 | None |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F4135 | None |
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I0516 | None |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | None |
Insulin (bovine) | Sigma | I5879 | None |
Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693159001 | None |