Incapsulamento termogenico preadipocytes al trapianto nel tessuto adiposo Depositi tessuti

Summary

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Abstract

Incapsulamento delle cellule è stato sviluppato per intrappolare cellule vitali all'interno delle membrane semi-permeabili. Le cellule incapsulate trapiantate possono scambiare metaboliti a basso peso molecolare in tessuti dell'ospite trattato per conseguire sopravvivenza a lungo termine. La membrana semipermeabile permette innestato cellule incapsulate per evitare il rigetto da parte del sistema immunitario. La procedura di incapsulamento è stato progettato per consentire un rilascio controllato di composti bioattivi, come l'insulina, altri ormoni e citochine. Qui si descrive un metodo per l'incapsulamento di cellule catabolici, che consumano lipidi per la produzione di calore e la dissipazione di energia (termogenesi) nel tessuto adiposo intra-addominale di topi obesi. L'incapsulamento di cellule catabolici termogenica potrebbe essere potenzialmente applicabili alla prevenzione e il trattamento dell'obesità e il diabete di tipo 2. Un'altra potenziale applicazione di cellule catabolici può includere la disintossicazione da alcool o altri metaboliti tossici e inquinanti ambientali.

Introduction

L'aumento dell'incidenza delle malattie croniche ¹ ha stimolato studi sul trapianto di popolazioni di cellule terapeutiche ^2. Le cellule staminali singenici o allogeniche sono i tipi di cellule più comunemente usati per queste applicazioni ^2. Tuttavia, questi trattamenti non consentono il controllo della differenziazione e migrazione delle cellule staminali dopo l'impianto e non sono convenienti. Il trapianto di cellule geneticamente modificate con funzioni benefiche anticipa migliorare il trattamento di molte malattie. Tuttavia, le modifiche genetiche di cellule vengono riconosciuti dal sistema immunitario dell'ospite, quindi, questi trattamenti richiedono immunosoppressione ^3. L'incapsulamento di cellule che producono l'insulina è stato sviluppato dal Dr. Chang ^4. La tecnica si basa sulla incapsulamento delle cellule in goccioline alginato che vengono immerse in una soluzione di cloruro di calcio. Molecole alginato consistono di acido mannuronico (M) e guluronico (G) e possono essere collegati da Ca ²⁺. Dopo gelificazione, le perle sono sospese una soluzione di poli-L-lisina (PLL). Durante questa fase, PLL lega al G e M nelle molecole alginato che stabilisce membrana della capsula. La porosità della membrana della capsula può essere modulata variando le concentrazioni M e PLL, il tempo di incubazione, e la temperatura. Il legame del PLL dipende anche dal tipo e dalla concentrazione di alginato. Matrici alginato reticolato con ioni Ca ^2+, sono instabili in ambiente fisiologico o in soluzioni tampone comuni con alta concentrazione di fosfato e ioni citrato. Questi buffer possono estrarre Ca ²⁺ dal alginato e liquefare il nucleo. Liquefazione del nucleo alginato fornisce spazio all'interno delle capsule per il movimento e la crescita cellulare. Cellule incapsulate in alginato polyanionic con policationico poli-L-lisina (APL) sono impermeabili per immunoglobuline ma hanno afflusso di nutrienti e l'efflusso di tossine. Queste proprietà consentono APL lungo termine survival di cellule incapsulate dopo il trapianto in host geneticamente diverse. Elliott et al. Riportato la sopravvivenza di funzionamento delle cellule pancreatiche suina incapsulati in un paziente umano nove anni dopo l'impianto ^5.

Tecniche di incapsulamento possono essere classificati in microincapsulazione (3-800 micron) e macroincapsulazione (maggiore di 1000 micron). Le microcapsule sono più durevoli macrocapsules ^6. Fin dalla sua scoperta dal Dr. Chang e colleghi nel 1964, microincapsulazione è stato ampiamente utilizzato per l'incapsulamento delle cellule anabolizzanti che producono insulina, altri ormoni e molecole bioattive ^7. Questi trattamenti hanno affrontato diverse sfide nel tessuto ospite tra cui la fibrosi e la risposta immunitaria ^8. Inizialmente, gli effetti collaterali legati alla qualità dei biopolimeri sono stati risolti. Tuttavia, il trapianto di cellule anabolizzanti avvia ancora effetti collaterali, quali la fibrosi, come risultato di ormone overproduzione di fuori di una ghiandola specializzata.

Negli ultimi decenni, l'obesità e il diabete di tipo 2 ha raggiunto proporzioni epidemiche ^9. Più del 30% delle persone adulte in tutto il mondo sono in sovrappeso e obesi ^10. Aumento intra-addominale (IAB) la formazione di grasso aumenta l'incidenza di infiammazione cronica e promuove diabete di tipo 2, le malattie cardiovascolari, alcuni tipi di cancro, e di altre patologie ^11-13. Molte evidenze suggeriscono che la patogenesi associato con il grasso IAB può essere evitato dagli adipociti specifici. Recenti studi hanno dimostrato che il trapianto di adipociti sottocutanei in regione IAB può migliorare il metabolismo e ridurre l'obesità e insulino-resistenza nei roditori in vivo ^14. Efficace riduzione di obesità e insulino resistenza è stata associata con adipociti termogenica grado di dissipare l'energia sotto forma di calore ^15,16. Modifica termogenica adipociti può essere ottenuto mediante trasfezione stabiledi geni che partecipano al disaccoppiamento protonico mitocondriale, come la proteina di disaccoppiamento 1 (Ucp1) o di geni che regolano l'espressione di altri geni Ucp1 e termogenica ^15,16. Nostri studi recenti hanno dimostrato che la deficienza in aldeide deidrogenasi 1 a1 (Aldh1a1) porta al rimodellamento termogenico di grasso IAB che riduce l'obesità e insulino-resistenza in questi topi ^17,18. In particolare, l'incapsulamento di termogenico Aldh1a1 carente (Aldh1a1 – / -) preadipocytes media stesso effetto terapeutico di grassi IAB in obesi topi wild-type, suggerendo nuove opportunità terapeutiche per il trattamento di IAB grasso ^18. Nelle impostazioni sperimentali, le cellule incapsulate permettono ai ricercatori di studiare gli effetti di specifiche popolazioni cellulari in modo economicamente vantaggioso ^19. Qui si discute il metodo di incapsulamento di una linea cellulare catabolico termogenica e il suo laboratorio e applicazione terapeutica in un modello murino di obesità. Il protocollo descrive three fasi per la produzione di microcapsule (Figura 1): la formazione delle microsfere di alginato (Figura 1A), la formazione del policationico poli-L-lisina (PLL) membrane sulla superficie di microsfere (Figura 1B), e la rimozione del nuclei di alginato (Figura 1C).

Protocol

Il protocollo di studio è stato approvato da The Ohio State University comitati etici. Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal protocollo IACUC. Tutte le procedure sono state eseguite sotto l'armadio di livello 2 di biosicurezza con flusso laminare. Abbiamo seguito tutti i requisiti e le procedure di sicurezza standard. La tecnica di microincapsulazione per la preparazione di microcapsule è stata eseguita come descritto 17, 18. 1. Preparativi di materiali <o…

Representative Results

La Figura 1 mostra che ogni fase della produzione microsfere può essere controllato al microscopio. La Figura 2A mostra come co-coltura adipociti con un monostrato di cellule incapsulate. Figura 2B è un esempio rappresentativo di uno studio quantitativa utilizzando adipociti / microcapsule co-culture sono stati descritti nella sezione 5. Lisati degli adipociti sono stati analizzati usando Western Blot. Cellule incapsulate non sono state analizzate in questo esperiment…

Discussion

Vari metodi sono stati utilizzati per incapsulare cellule, comprese l'essiccazione, estrusione, ed emulsione ^19. In questo metodo, le perline alginato vengono estrusi attraverso un ago, poi rivestito con PLL e il nucleo alginato sarà sciolto per completare l'incapsulamento. Anche se questo metodo è stato usato per anni, formazione delle perline con la dimensione desiderata e la forma sferica è ancora difficile. La dimensione delle capsule è fortemente dipendente dalla viscosità della soluzione di…

Materials

Encapsulation device (VAR V1)	Nisco	LIN-0042	None
KD scientific syringe pump	KD scientific	780100Y	None
Olympus microscope	Olympus Optical	IX70-S8F2	None
Sodium alginate	Sigma	MKBP8122V	None
Poly-l-lysine hydrobromide (PLL)	Sigma	020M5006V	None
Calcium chloride	Sigma	SLBJ2662V	None
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma	030M0200	None
Sodium chloride	Sigma	SLBD2595V	None
Mini-PROTEAN TGX Gels	Bio-Rad	456-1093	None
ATGL primary antibody (from rabbit)	Cell Signaling	2138S	None
Secondary anti body (anti rabbit)	LI-COR	926-68071	None
Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer	Boston BioProducts	D25Y6Z	None
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	RNBD2893	None
Trypsin	Gibco	25200-056	None
Cortizone 10 anti-itch ointment	Cortizone 10	C4029138	None
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-092	None
Newborn calf serum (CS)	Sigma	N4762	None
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F4135	None
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma	I0516	None
Dexamethasone	Sigma	D4902	None
Insulin (bovine)	Sigma	I5879	None
Protease inhibitor cocktail tablets	Roche	4693159001	None