In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.
Synthetische materialen zijn bekend aan klinische complicaties zoals ontsteking, vernauwing en infecties teweegbrengen wanneer geïmplanteerd vasculaire substituten. Collageen is uitgebreid gebruikt voor uiteenlopende biomedische toepassingen en als een alternatief voor kunststoffen vanwege de inherente biologische verenigbaarheid (bijv lage antigeniciteit, ontsteking, en cytotoxische responsen). Echter, de beperkte mechanische eigenschappen en de daarmee verband houdende lage hand-vermogen van collageen gels hun gebruik als scaffold materialen voor vasculaire tissue engineering bemoeilijkt. Daarom is de gedachte achter dit werk was de eerste die cellularized collageen gels in een buisvormige-vormige geometrie en tweede werktuigkundige op gladde spiercellen verbeteren gedreven reorganisatie van collageen matrix om weefsels stijf genoeg om te worden behandeld verkrijgen.
De hier beschreven strategie is gebaseerd op de directe montage van collageen en gladde spiercellen (construct) in een 3D-cilndrical geometrie met behulp van een vormgevingstechniek. Dit proces vereist een rijpingsperiode, waarin de constructen worden gekweekt in een bioreactor onder statische condities (zonder aangebrachte externe dynamische mechanische invloeden) gedurende 1 of 2 weken. De "statische bioreactor" biedt een bewaakte en gecontroleerde steriele omgeving (pH, temperatuur, gasuitwisseling, toevoer van voedingsstoffen en afvoer van afval) aan de constructies. Tijdens kweekperiode werden diktemetingen uitgevoerd om de cellen gedreven hermodellering van het collageen matrix evalueren en glucoseconsumptie en lactaatproductie werden gemeten volgen de cellen metabolische activiteit. Tenslotte werden de mechanische en visco-elastische eigenschappen beoordeeld voor de verkregen buisvormige constructen. Daartoe specifieke protocollen en concentratie kennis (manipulatie, grijpen, die in gehydrateerde milieu, etc.) ontwikkeld om het gemanipuleerde weefsel te karakteriseren.
Vasculaire tissue engineering voorziet verschillende strategieën gericht op de fabricage van gemanipuleerde schepen, met inbegrip van enten op basis van synthetische steigers, cellaag-gebaseerde-tissue engineered bloedvaten (TEBVs), en de extracellulaire matrix (ECM)-componenten op basis TEBVs. Van deze benaderingen synthetische polymeren vertonen goede mechanische eigenschappen, maar een gemeenschappelijk nadeel als ze niet bioactiviteit 1. De cellaag gebaseerde werkwijze maakt de productie van technisch vasculaire substituten met hoge mechanische eigenschappen, maar de tijd die nodig is om dergelijke transplantaten te produceren ongeveer 28 weken 2. Natuurlijke biopolymeren van de ECM, zoals collageen, elastine, fibrine 3 of een combinatie daarvan, blijft de gouden standaard materialen voor tissue engineering scaffolds. Dit is vooral voor de reden dat deze materialen bezitten in het algemeen een goede biocompatibiliteit terwijl de mogelijkheid om functionele cellulaire responsen induceren 4-5. Onder deze biopolymeers, type I collageen is een van de meest voorkomende en overheersende dragende eiwit van de ECM in vele weefsels zoals huid, bloedvaten en pezen. Uitgebreide werk is uitgevoerd op de mechanische eigenschappen van collageen 6-8, maar er zijn slechts een paar studies over cellulaire verbouwing van collageen gels tijdens de statische rijping geweest. Cellulaire remodeling verwijst naar de structurele modificatie van de collageenmatrix geïnduceerd door cellen die de stabiliteit van de collageenvezels netwerk 9 kunnen beïnvloeden. Als natuurlijke scaffold, relatief grote hoeveelheden type I collageen geïsoleerd, gesteriliseerd en opgeslagen uit verschillende bronnen, zoals de rat-tail pezen 10. Inzicht cellulaire interacties met collageen en de bijbehorende globale mechanische gedrag van de cellularized collageen scaffolds (constructs) is een essentiële stap voor de opbouw van weefsels. Collageen gebaseerde TEBVs kan worden verwerkt door cellen direct mengen met collageentijdens gel voorbereiding en verdere gegoten in specifieke vormen zoals buisvormige en vlakke 11. Vasculaire cellen in de gels vermenigvuldigen en het type renovatie I collageen 12. Aldus is deze werkwijze omzeilt de noodzaak van specifieke macroporositeit dat een van de belangrijke problemen bij de ontwikkeling van scaffolds voor weefselregeneratie toepassingen vertegenwoordigt. De belangrijkste nadelen van collageen gelen zijn hun lage mechanische eigenschappen in vergelijking met synthetische materialen 13.
In deze studie levensvatbaar weefsel met een homogene verdeling van cellen werd ontwikkeld door direct mengen van collageen met cellen in een enkelvoudig proces. "Statische bioreactors" werden gebruikt voor 1 of 2 weken statische rijping van de cellularized collageengels (zonder aangezette externe dynamische mechanische invloeden). Tijdens de kweek, collageen matrix remodeling plaatsgevonden, waardoor structurele versterking aan de constructen. Bovendien zijn deze constructen waren ready worden overgebracht naar een roterende wand bioreactor en een homogene endothelium werd bereikt. Daarnaast is in het onderzoek een specifieke mechanische testprotocol wordt voorgesteld een geschikte nieuwe aanpak te waarborgen bij het karakteriseren van de mechanische eigenschappen van het buisvormige zachte weefsels.
Samenvattend, dit werk presenteert een werkwijze voor de in vitro snelle fabricage en rijping van vasculaire weefsels die sterk genoeg te behandelen niet alleen biologische en mechanische karakteristieken, maar ook voor verdere mechanische conditionering in een dynamische bioreactor, die als cruciaal zijn stap in de regeneratie van weefsels.
Onder de gemeenschap van vaatweefsel ingenieurs, zijn enorme inspanningen gedaan om de tunica media layer verantwoordelijk voor de mechanische stabiliteit van bloedvaten 16 te reproduceren. Aangezien het pionierswerk van Weinberg Bell 17, is collageen op grote schaal gebruikt als een matrix voor vasculaire tissue engineering vanwege zijn biologische verenigbaarheid, niet-immunogene eigenschappen en mogelijkheden. Het gebruik van collageen vormt een grote uitdaging voor onderzoekers, aangezien dit materiaal niet gemakkelijk te hanteren, vanwege de intrinsieke gebrek aan mechanische stijfheid. Manipulaties tijdens scaffold preparaat kan de steigers beschadigen compromitteren ze voor verder gebruik.
De in dit werk beschreven techniek kan: i) cellularized collageen gels ingenieur een buisvormige geometrie, ii) biologische weefsel engineering sterk genoeg na korte static rijpingsduur (1 of 2 weken) worden behandeld, iii) alssess mechanische en visco-elastische eigenschappen van dergelijke buisvormige biologische weefsels in 2 richtingen. Cellen in de gel spelen een belangrijke rol bij de collageen matrix remodeling. Tijdens de rijpingsperiode, contractiele SMC's leidde tot de verdichting van de gels waardoor een constructie met een hogere mechanische stabiliteit dat zou kunnen worden beoordeeld in de lengterichting en de omtrek richtingen. Daarna HUVEC geënt in de luminale kant van de constructen gegenereerde homogene en levensvatbare endotheel, waardoor de geschiktheid van de collageen gels vasculaire tissue engineering toepassingen demonstreren.
De in dit werk bioreactor is speciaal ontworpen om een optimale omgeving voor celgroei bieden tijdens statische rijping. Bovendien werden de inrichtingen ontwikkeld voor het karakteriseren van de mechanische en visco-elastische eigenschappen van de constructen ontworpen met het doel om mogelijke beschadiging inherent aan de manipulatie van verminderingdergelijke delicate materialen. Daarom werd de statische bioreactor voorzien van een 0,22 urn filter en een filtermembraan op de dop (stap 1.1.2, figuur 1A en B) dat toegestaan gasuitwisseling tussen cultuur medium in het reservoir en de incubator, terwijl het houden van een steriele cultuur omgeving. De luer septum onderin werd gebruikt als een poort voor cultuurmedium bemonstering en veranderen in statische kweek. Kritische stappen tijdens construct fabricage en kenmerken worden beschouwd. Alle manipulaties (uitgevoerd in stap 2.1.1 en de daaropvolgende stappen) de steriliteit van het systeem kunnen veranderen werden uitgevoerd in een steriele biologische kap. Cellen en collageengel mengsel preparaat werd behandeld op ijs om het geleringsproces vertragen (stappen 2.1.4 tot 2.1.7). Bij stap 2.1.7, geen luchtbellen ingesloten in het mengsel voorafgaand aan de gelering zijn potentiële stress-concentratie gebieden die in gevaar kunnen brengen van de swinstgevendheid van de constructen. Daarom is het verwijderen van dergelijke luchtbellen vereist lichtjes schudden van de montage of het gebruik van medische vacuum gedurende 3 min voor ontgassing in steriele omstandigheden. Tenslotte werden de handgrepen speciaal ontworpen voor het handhaven van de as van de doorn in het centrale buisvormige mal tijdens gelering en voor het nemen delicate manipulatie van de constructen tijdens het oogsten (verwijdering van de doorn, sectie 2.4) voor endotheel en voor het vergemakkelijken van de montage op het mechanische systeem (longitudinaal tests).
Het onderhavige protocol stelt een origineel eenvoudig te verwerken alternatieve benadering wapening van collageen gels constructen gebaseerd op de natuurlijke inherente contractiele vermogen van SMC. Algemene technieken van collageen matrices wapening gebruik worden gemaakt van fysische en chemische verknopingsmiddelen die nadelige effecten op cellen-matrix interacties 18 kunnen hebben – 20. De fabricagetechniek gepresenteerddit werk staat regisseren deze cellen gedreven remodeling proces om een tissue-engineered constructie met gerichte mechanische eigenschappen opleveren zonder fysieke of chemische behandeling.
Karakterisering van de mechanische en visco-elastische eigenschappen van gehydrateerde collageen gels is een grote uitdaging. In dit perspectief is het huidige protocol beschrijft een originele eenvoudige en efficiënte methode voor het bepalen van de mechanische eigenschappen van buisvormige zachte weefsels. Deze karakterisering kan worden uitgevoerd niet alleen in de omtrekrichting maar ook in de langsrichting, aan de gehele buisvormige structuur. Tijdens mechanische karakterisatie, temperatuur, waterig milieu, pH en ionsterkte zijn enkele van de omgevingsfactoren waarvan bekend is dat het mechanisch gedrag van het gemanipuleerde weefsel 21 grote invloed. Vandaar dat de huidige werk suggereert een originele set-up en protocol voor de mechanische karakterisering van biologische weefsels in een zeerreproduceerbare pseudo-fysiologische omgeving (zoutoplossing bij 37 ° C en pH 7.4). Om het beste van onze kennis, dit soort karakterisering is nooit elders gemeld.
Samenvattend, de in dit werk voorgesteld techniek toont het grote potentieel van directe mengen van cellen met collageen voor vasculaire tissue engineering toepassingen. Deze methode samen met de mechanische karakterisering en endotheelvorming proces vormen hoge polyvalent protocollen. Vandaar dat, door middel van lichte wijzigingen van de set-ups en protocollen terwijl het dezelfde reden, de belangrijkste eisen voor engineering vaatweefsel equivalenten kunnen worden zoals aangepakt als een snelle en eenvoudige verwerking, waaronder endotheelvorming, en de mogelijkheid om te worden toegepast op een breed scala van zachte weefsels met verschillende lengtes en diameters. Voorts verschillende hechtende celtypen, ECM eiwitten en gevormde geometrieën kunnen worden onderzocht op een aantal gerichte applications, zoals engineering pezen, huidtransplantaties, cardiale patches, zenuwen, onder anderen. Hoewel de mechanische eigenschappen van de constructen zijn bemoedigend, ze nog steeds lager dan die van cellen. In deze context, we ervan overtuigd dat een zeer korte statisch gerijpt is een belangrijke stap naar de dynamische stimulatie in een bioreactor, hetgeen leidt tot een hogere structurele integriteit en mechanische sterkte. Echter, de mogelijkheid om snel te produceren-tissue engineered cellularized collageen-gebaseerde constructen geschikt voor mechanische en histologische analyses maakt de statische bioreactor hierin beschreven een nuttig en veelbelovend hulpmiddel om inzicht te krijgen in de wisselwerking tussen cellen en ECM te bieden tijdens de groei en verbouwen, of zelfs worden gebruikt als model voor therapieën en geneesmiddelafgiftesystemen.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd gefinancierd door de Natural Science and Engineering Research Council van Canada, de Canadese Institute for Health Research en de CHU de Québec Research Center.
CellTreat 50 mL Bio-Reaction tubes | CELLTREAT Scientific Products | 229-475 | Centrifuge tube |
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45503-04 | Luer fittings for "gas-exchange port" |
Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45500-04 | Luer fittings for the "medium sampling port" |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-17 | Tube 1 and 2 for the gauze grippers |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-16 | Tube 3 for the gauze grippers |
Silastic Medical adhesive silicone, type A | Dow Corning | – | Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor |
Polyvent 4 Vessel venting filters | Whatman | 6713-0425 | Filter for "gas exchange port" |
Rod. PP. stirring. 8’’ | Scienceware | 377660008 | Mandrel |
Stopper silicone rubber 00 PK12 | VWR | 59590-084 | Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube |
Krytox PFPE/PTFE Greases | Dupont | GPL 202 | Medical grade grease for covering the mandrel |
Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | Cell culture |
Xiameter RTV-4130-J base and curing agent | Dow Corning | – | C-shaped silicone support for endothelialization |
Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco (Life Technology) | 11995-065 | Cell culture |
Pure acetone (99%) | Laboratoire Mat Inc. | AP0102 | Chemical for collagen extraction |
Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%) | Fisher Scientific | AC610080040 | Chemical for collagen extraction |
0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%; Fisher Scientific, | Fisher Scientific | FL070494 | Chemical for collagen extraction |
Chloroform solution (99%) | Laboratoire Mat Inc. | CR 0179 | Chemical for collagen extraction |
Hepes | Sigma-Aldrich | 163716 | Chemical for construct preparation |
NaOH | Laboratoire Mat Inc. | SR-0169 | Chemical for construct preparation |
LaserMike 136 | LaserMike | Series 183B | Scanning laser interferometer |
ElectroPulse MicroTester | Instron Corporation | – | Micromechanical Tester |
HyClone Media M199/EBSS, 500 mL | GE Healthcare Life Sciences | SH30253.01 | Component of cell culture medium |
Fetal bovine serum HI – 500mL | Gibco | SH 30396.03 | Component of cell culture medium |
Porcine serum (PS) | Sigma-Aldrich | P9783 | Component of cell culture medium |
Penicillin-Streptomicin | Gibco | 15140-122 | Component of cell culture medium |
Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP661-50 | Saline solution |
Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red | Sarstedt Inc. | 83.1812.002 | Cell culture |
ColorpHast- pH-indicator strips (pH=6.5-10.0) | EMD | 9583 | pH measurements |
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 mL vial | BD Biosciences – Discovery Labware | 356230 | Concentrate protein mixture for endothelialization process |
LifeCam VX-3000 | Microsoft | – | Thickness measurement |
Biochemical analyzer, DxC600 | Beckman Coulter Unicell Synchron | – | Glucose and lactate concentrations measurements |
Collagen fibers | Rat tails | – | Collagen was extracted in the laboratory |
Porcine smooth muscle cells (pSMCs) | Porcine aortas | – | pSMCs were isolated in the laboratory |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Human umbilical veins | – | HUVECs were isolated in the laboratory |