In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.
Os materiais sintéticos são conhecidos para iniciar complicações clínicas tais como inflamação, estenose, e infecções quando implantado como substitutos vasculares. O colagénio tem sido extensivamente utilizado para uma vasta gama de aplicações biomédicas e é considerado uma alternativa válida para os materiais sintéticos, devido à sua biocompatibilidade inerentes (isto é, baixa antigenicidade, inflamação e respostas citotóxicas). No entanto, as propriedades mecânicas limitadas ea mão baixa-capacidade de géis de colágeno relacionados têm dificultado o seu uso como materiais de andaime para engenharia de tecido vascular. Portanto, a lógica por trás deste trabalho foi a primeira a projetar géis de colágeno celularizados em uma geometria em forma de tubular e segundo para aprimorar células musculares lisas reorganização conduzida de matriz de colagénio para obter tecidos duros o suficiente para ser manuseado.
A estratégia aqui descrita baseia-se na montagem directa de colagénio e células do músculo liso (construção) num cyli 3Dgeometria ndrical com a utilização de uma técnica de moldagem. Este processo requer um período de maturação, durante o qual as construções são cultivadas num biorreactor em condições estáticas (sem restrições mecânicas dinâmicas externa aplicada) para 1 ou 2 semanas. O "biorreator estático" fornece um ambiente estéril monitorados e controlados (pH, temperatura, troca gasosa, o fornecimento de nutrientes e remoção de resíduos) para as construções. Durante o período de cultura, as medições de espessura foram realizados para avaliar a remodelação da matriz de colagénio-células impulsionadas, e consumo de glucose e as taxas de produção de lactato foram medidos para monitorizar a actividade metabólica das células. Finalmente, as propriedades mecânicas e viscoelásticas foram avaliadas para as construções tubulares resultantes. Para este fim, os protocolos específicos e um know-how concentrado (manipulação, segurar, que trabalha em ambiente hidratado, e assim por diante) foram desenvolvidas para caracterizar os tecidos de engenharia.
Engenharia de tecido vascular prevê diferentes estratégias que visam a fabricação de vasos de engenharia, incluindo enxertos sintéticos baseados em andaimes, vasos sanguíneos engenharia de tecidos à base de folha de celular (TEBVs) e matriz extracelular (MEC) TEBVs componentes baseados. Entre essas abordagens, polímeros sintéticos apresentam boas propriedades mecânicas, mas compartilham uma desvantagem comum, pois falta uma bioatividade. O método baseia-camada de células permite a produção de substitutos vasculares artificiais, com altas propriedades mecânicas, mas o tempo necessário para produzir tais enxertos é de aproximadamente 28 semanas 2. Biopolímeros naturais da ECM, tais como colagénio, elastina, fibrina 3 ou uma combinação dos mesmos, continuam a ser os materiais padrão de ouro para andaimes para engenharia de tecidos. Isto é principalmente pela razão de que estes materiais possuem geralmente uma boa biocompatibilidade ao ser capaz de induzir respostas celulares funcionais 4-5. Entre estes biopolímeros, colagénio do tipo I é uma das proteínas de suporte de carga mais abundante e predominante da ECM em muitos tecidos, como a pele, vasos sanguíneos e dos tendões. Um trabalho extensivo tem sido realizados sobre as propriedades mecânicas do colágeno 6-8, mas tem havido poucos estudos sobre remodelamento celular de géis de colágeno durante a maturação estática. Remodelamento celular refere-se às modificações estruturais da matriz de colágeno induzida por células que poderiam afetar a estabilidade da rede de fibrilas de colágeno 9. Como um andaime natural, relativamente grandes quantidades de colagénio do tipo I pode ser isolado, esterilizado e armazenado a partir de diferentes fontes, tais como os tendões da cauda de ratos-10. Compreender interacções celulares com colagénio e os comportamentos relacionados mecânicas globais dos andaimes de colagénio celularizados (construções) é um passo essencial para a construção de tecidos. TEBVs à base de colagénio pode ser processado através da mistura de células directamente com colagéniodurante a preparação do gel e moldado em formas mais específicas tais como tubular e plana 11. Células vasculares no interior dos géis proliferar e tipo I colágeno remodelação 12. Assim, este método evita a necessidade de macroporosidade específico que representa um dos problemas significativos no desenvolvimento de andaimes para aplicações de engenharia de tecidos. No entanto, as principais desvantagens de géis de colagénio são as suas propriedades mecânicas baixas em comparação com materiais sintéticos 13.
Neste estudo, um tecido viável, com uma distribuição homogénea de células foi manipulada por mistura directa de colagénio com células em um processo de um só passo. "estáticas" bioreactores foram usadas para o 1 ou 2 semanas de maturação estática dos géis de colagénio celularizados (sem restrições mecânicas dinâmicas externas aplicadas). Durante a cultura, a remodelação da matriz de colagénio ocorreu, proporcionando assim o reforço estrutural para as construções. Além disso, estas construções foram rEady para ser transferido para um biorreactor de parede rotativa e um endotélio homogénea foi alcançado. Além disso, neste trabalho um protocolo específico testes mecânicos também é proposto o fornecimento de uma nova abordagem adequada na caracterização das propriedades mecânicas dos tecidos moles tubulares.
Em resumo, este trabalho apresenta um método para a fabricação e a maturação dos tecidos vasculares que são suficientemente fortes para serem tratadas, não só para caracterizações biológicas e mecânicas, mas também para outras condicionado mecânica num biorreactor dinâmico, o que é considerado essencial uma rápida in vitro passo na regeneração de tecidos.
Entre a comunidade de engenheiros de tecidos vasculares, enormes esforços têm sido feitos para reproduzir a camada de túnica média responsável pela estabilidade mecânica dos vasos sanguíneos 16. Desde o trabalho pioneiro de Weinberg e Bell 17, colagénio tem sido amplamente utilizado como um andaime para engenharia de tecido vascular devido a sua biocompatibilidade, propriedades não imunogénicas e disponibilidade. No entanto, a utilização de colagénio representa um grande desafio para os investigadores, como este material não é fácil de manusear, devido à falta de rigidez intrínseca mecânica. Manipulações durante a preparação do andaime pode danificar os andaimes, comprometendo-los para uso posterior.
A técnica descrita neste trabalho permite: i) para a engenharia géis de colagénio em celularizados uma geometria de forma tubular, ii) para a engenharia de tecidos biológicos suficientemente forte para ser manuseado após um curto período de maturação estática (uma ou duas semanas), iii) como apropriedades mecânicas e viscoelásticas sess de tais tecidos biológicos em forma tubular em duas direcções. As células no gel desempenhar um papel-chave na remodelação da matriz de colagénio. Durante o período de maturação, SMCs contráteis levou à compactação dos géis produzindo uma construção com maior estabilidade mecânica que poderiam ser avaliados nas direções longitudinais e circunferenciais. Em seguida, células HUVEC semeadas no lado luminal das construções gerado um endotélio homogénea e viável, demonstrando assim a adequação dos géis de colagénio para aplicações de engenharia de tecidos vasculares.
O biorreator apresentada neste trabalho foi projetado especificamente para fornecer um ambiente ideal para o crescimento celular durante a maturação estática. Além disso, os dispositivos desenvolvidos para a caracterização das propriedades mecânicas e viscoelásticas das construções foram concebidos com o objectivo de reduzir qualquer dano potencial inerente à manipulação detais materiais delicados. Assim, o biorreactor foi estático equipado de um filtro de 0,22 um e uma membrana de filtro na tampa (passo 1.1.2, Figura 1A e B) que permitiu a troca gasosa entre o meio de cultura no interior do reservatório e da incubadora, mantendo um ambiente de cultura estéril. O septo luer na parte inferior foi usada como uma porta de amostragem de meio de cultura e durante a cultura estática mudando. Alguns passos críticos têm de ser considerados durante a fabricação construção e caracterizações. Todas as manipulações realizadas no (passo 2.1.1 e nos passos subsequentes) que podem alterar a esterilidade do sistema foram realizados numa hote estéril biológica. Células e gel de colágeno preparação mistura foi tratada com gelo, a fim de retardar o processo de gelificação (passos 2.1.4 a 2.1.7). No passo 2.1.7, quaisquer bolhas de ar aprisionadas na mistura antes da gelificação são zonas de concentração de tensões potenciais que podem comprometer a slucratividade das construções. Portanto, a remoção de tais bolhas de ar requer um pouco agitando a montagem ou usando médicos de vácuo durante 3 minutos para Desgasificação em condições estéreis. Por último, as garras foram concebidos especificamente para manter o eixo do mandril central no molde tubular durante a gelificação e para permitir a manipulação delicada dos construtos durante a colheita (remoção do mandril, secção 2.4), para endotelização, e para facilitar a montagem sobre o sistema mecânico (testes longitudinais).
O presente protocolo propõe uma abordagem original e fácil de processo alternativo de reforço de géis de colágeno construções com base no potencial inerente contrátil natural de PMEs. As técnicas comuns de matrizes de colagénio reforço envolvem o uso de agentes de reticulação físicas e químicas que podem ter efeitos nocivos sobre as interacções de células-matriz 18-20. A técnica de fabricação apresentado emeste trabalho permite dirigir este processo de remodelação células orientado para produzir uma construção de engenharia de tecidos, com propriedades mecânicas em causa sem qualquer tratamento físico ou químico.
Caracterização de propriedades mecânicas e viscoelásticas de géis de colágeno hidratado é um grande desafio. Nesta perspectiva, o presente protocolo descreve um método simples e eficiente original para avaliar as propriedades mecânicas dos tecidos moles tubulares. Esta caracterização pode ser realizada não só na direcção periférica, mas também na direcção longitudinal, directamente em toda a estrutura tubular. Durante a caracterização mecânica, temperatura, ambiente aquoso, pH e força iónica são alguns dos factores ambientais que são conhecidos por afectar drasticamente o comportamento mecânico dos tecidos biológicos 21. Assim, o presente trabalho sugere um set-up e protocolo original para a caracterização mecânica dos tecidos biológicos em um ambiente altamentepseudo-reprodutível ambiente fisiológico (solução salina a 37 ° C e pH 7,4). Para o melhor de nosso conhecimento, este tipo de caracterização nunca foi relatado em outros lugares.
Em conclusão, a técnica proposta neste trabalho demonstra o elevado potencial de mistura directa de células com colagénio para aplicações de engenharia de tecidos vasculares. Este método, juntamente com o processo de caracterização mecânica e endotelização constituem protocolos polivalentes elevados. Assim, através de ligeiras modificações das set-ups e protocolos, mantendo o mesmo raciocínio, os principais requisitos para a engenharia de equivalentes de tecidos vasculares podem ser abordados, como o processamento rápido e sem complicações, incluindo Endotelização, ea possibilidade de ser transposto para uma ampla gama de suave tecidos com vários comprimentos e diâmetros. Além disso, diferentes tipos de células aderentes, proteínas da MEC e geometrias moldados podem ser investigados quanto a um número de applicati segmentadosons, tais como tendões de engenharia, enxertos de pele, manchas cardíacas, nervos, entre outros. Embora as propriedades mecânicas das construções são encorajadores, eles são ainda mais baixos do que os de tecidos nativos. Neste contexto, acreditamos fortemente que um período de maturação estática muito curto é um passo crucial para a estimulação dinâmica em um biorreator, conduzindo assim a uma maior integridade estrutural e estabilidade mecânica. No entanto, a possibilidade de produzir rapidamente celularizados construções à base de colágeno engenharia de tecidos adequados para mecânica e análises histológica faz com que o biorreator estática aqui descrita uma ferramenta útil e promissor para fornecer informações sobre a interação entre células e ECM durante o crescimento e remodelação, ou mesmo para ser utilizada como um modelo para as terapias e sistemas de entrega de drogas.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi financiada pela Ciência Natural e do Conselho de Investigação do Canadá Engenharia, do Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde e do CHU de Québec Centro de Pesquisa.
CellTreat 50 mL Bio-Reaction tubes | CELLTREAT Scientific Products | 229-475 | Centrifuge tube |
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45503-04 | Luer fittings for "gas-exchange port" |
Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45500-04 | Luer fittings for the "medium sampling port" |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-17 | Tube 1 and 2 for the gauze grippers |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-16 | Tube 3 for the gauze grippers |
Silastic Medical adhesive silicone, type A | Dow Corning | – | Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor |
Polyvent 4 Vessel venting filters | Whatman | 6713-0425 | Filter for "gas exchange port" |
Rod. PP. stirring. 8’’ | Scienceware | 377660008 | Mandrel |
Stopper silicone rubber 00 PK12 | VWR | 59590-084 | Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube |
Krytox PFPE/PTFE Greases | Dupont | GPL 202 | Medical grade grease for covering the mandrel |
Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | Cell culture |
Xiameter RTV-4130-J base and curing agent | Dow Corning | – | C-shaped silicone support for endothelialization |
Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco (Life Technology) | 11995-065 | Cell culture |
Pure acetone (99%) | Laboratoire Mat Inc. | AP0102 | Chemical for collagen extraction |
Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%) | Fisher Scientific | AC610080040 | Chemical for collagen extraction |
0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%; Fisher Scientific, | Fisher Scientific | FL070494 | Chemical for collagen extraction |
Chloroform solution (99%) | Laboratoire Mat Inc. | CR 0179 | Chemical for collagen extraction |
Hepes | Sigma-Aldrich | 163716 | Chemical for construct preparation |
NaOH | Laboratoire Mat Inc. | SR-0169 | Chemical for construct preparation |
LaserMike 136 | LaserMike | Series 183B | Scanning laser interferometer |
ElectroPulse MicroTester | Instron Corporation | – | Micromechanical Tester |
HyClone Media M199/EBSS, 500 mL | GE Healthcare Life Sciences | SH30253.01 | Component of cell culture medium |
Fetal bovine serum HI – 500mL | Gibco | SH 30396.03 | Component of cell culture medium |
Porcine serum (PS) | Sigma-Aldrich | P9783 | Component of cell culture medium |
Penicillin-Streptomicin | Gibco | 15140-122 | Component of cell culture medium |
Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP661-50 | Saline solution |
Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red | Sarstedt Inc. | 83.1812.002 | Cell culture |
ColorpHast- pH-indicator strips (pH=6.5-10.0) | EMD | 9583 | pH measurements |
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 mL vial | BD Biosciences – Discovery Labware | 356230 | Concentrate protein mixture for endothelialization process |
LifeCam VX-3000 | Microsoft | – | Thickness measurement |
Biochemical analyzer, DxC600 | Beckman Coulter Unicell Synchron | – | Glucose and lactate concentrations measurements |
Collagen fibers | Rat tails | – | Collagen was extracted in the laboratory |
Porcine smooth muscle cells (pSMCs) | Porcine aortas | – | pSMCs were isolated in the laboratory |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Human umbilical veins | – | HUVECs were isolated in the laboratory |