Rastreando alterações induzidas pela droga em Receptor de Pós-internalização Tráfico de Análise Colocalizational
Summary
Tráfico receptor modula a sinalização celular e a capacidade de resposta a ligandos e é, em si, que respondem a condições de células, incluindo a sinalização induzida por ligando. Aqui, descrevemos uma técnica poderosa e flexível para avaliar quantitativamente o tráfico receptor induzida por drogas utilizando imunomarcação ea análise colocalizational.
Abstract
The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.
Introduction
Receptores, especialmente receptores acoplados a proteína G (GPCRs), são rotineiramente tráfico intracelularmente, de e para a superfície da célula 1. Estes processos complexamente orquestradas e rigidamente controlados ditar complementos de receptores disponíveis das células e regulam a atividade do receptor temporais, a dessensibilização, e ressensibilização 2-4. Mais importante, estes processos são sensíveis a ambientes celulares, incluindo a actividade do receptor induzida por drogas ou inactividade. Isto é, as acções de ligandos nos receptores podem alterar o tráfico intracelular desses receptores, alterando desse modo a capacidade de resposta celular. Desta forma, ligantes externos exercer ainda mais efeitos sobre a função das células, mesmo para além clássicos mensageiro-a-efetoras cascatas 5,6.
Examinando tais mudanças no tráfico receptor induzida é difícil. Todas as técnicas disponíveis envolvem limitações. Ensaios de protecção de Biotina foram usadas para monitor receptores de superfície populações. Estes receptores são biotinilados e um curso temporal de imunoprecipi tacões é realizada para quantificar a redução em receptores biotinilados ao longo do tempo. Esta técnica essencialmente monitora a degradação progressiva de um inicial, marcado, a população de receptores 7, e é muito útil na construção de campos de tempo deste processo. Infelizmente, este ensaio não é capaz de monitorar qualquer outro processo de degradação do conjunto inicial de receptores, tais como a internalização, reciclagem, ou novos receptores. Além disso, a adição de um anticorpo na gama de 150kDa para um receptor na gama de 50 kDa pode alterar o tráfico do receptor de 8,9, e esta técnica podem ser difíceis de usar com receptores de baixa nível de expressão.
Outros procedimentos usar vários métodos para identificar compartimentos de tráfego intracelular (por exemplo, endosomes, etc.) e avaliar a sua co-localização com os receptores de interesse. Isto inclui os EUAe de sistemas heterólogos que expressam a proteína fluorescente-etiquetados construções quiméricas dos receptores e marcadores compartimento (GTPases por exemplo, Rab-familiares). Isso potencialmente permite o uso de imagens ao vivo de células, removendo questões relacionadas com a fixação e permeabilização. Enquanto poderosa, tal estratégia sofre das mesmas limitações dos sistemas heterólogos em geral: tag e nível de expressão de efeitos no tráfico de comportamento e incompatibilidade com tipos de células mais fisiologicamente representativos. Mais popularmente, corantes são utilizados para marcar facilmente compartimentos intracelulares (por exemplo, lisossomos, ostensivamente) 10. Corantes, no entanto, pode faltar especificidade (todos os organelos acidicos, no caso de corantes para lisossomas) e não avaliam o tráfico através de outros compartimentos. Ainda assim, estas técnicas permitem um controle considerável sobre o sistema e as condições experimentais e podem beneficiar os métodos de análise de co-localização aqui apresentados, abaixo.
O método we presentes aqui refina o rastreamento do tráfico receptor por co-localização. Usando imunocitoquímica (ICC) para rotular os marcadores apropriados, é possível identificar os múltiplos compartimentos intracelulares distintos. Isto também permite a utilização de culturas de células primárias fisiologicamente relevantes no lugar de sistemas heterólogos. Este protocolo envolve ICC, que fixa as células de interesse antes da marcação; isso permite rotulagem em um ponto de tempo específico após o tratamento (s) droga. Isso produz um "instantâneo" das associações compartimentos receptor globais naquele ponto no tempo. Com vários momentos, um timecourse de alterações de tráfego também podem ser construídos.
Resumidamente, as células são tratadas com droga, marcado para o receptor e o compartimento intracelular de interesse, confocally fotografada, e as fotomicrografias são analisados matematicamente para quantificar a co-localização do receptor e do compartimento 11. No nosso uso, examinámos a co-localização de um receptor com Rab5, Rab11, e lisossomais-associado proteína de membrana 1 (LAMP1). Estes marcadores identificar endosomes cedo, endosomes reciclagem, e os lisossomos, respectivamente. Estas medidas co-localização atuar como proxies para os processos abrangentes de internalização, reciclagem e degradação 12.
Tal como acontece com todas as técnicas, algumas limitações devem ser consideradas. Devido à necessidade de imagem cada neurónio individuais analisados, esta técnica pode tornar-se bastante trabalhoso, dependendo do número de condições e pontos de tempo envolvidos. Todos imunomarcação também devem lidar com os efeitos sobre a ultra-estrutura celular, localização de proteínas, e acessibilidade epitopo causados pela fixação e permeabilização 13.
Embora originalmente otimizado para uso com culturas primárias de neurônios sensoriais primários, este método é amplamente compatível com outros modelos de cultura banhado a monocamada.
O uso de um MEASUR quantificados matematicamentee de co-localização é, nomeadamente, muito mais metodologicamente rigorosas do que as técnicas anteriores utilizados para avaliar alterações de tráfego receptor, que muitas vezes dependiam de medidas vagos, subjetivos, como visualmente inspecionados sobreposições multi-canal 14.
Esta técnica é particularmente útil devido à sua grande compatibilidade com in vivo intervenções (antes da geração de cultura primária), in vitro intervenções (durante o crescimento da cultura), e uma variedade de rotulagem como alvo 15. Como tal, ele pode ser adaptado a muitas perguntas de investigação diferentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós otimizamos este protocolo para a análise de culturas primárias de adultos neurônios do gânglio da raiz dorsal (neurônios sensoriais primários). Ele também pode ser usado, com pouca ou nenhuma modificação, para células de cultura em monocamada banhado a amplamente. A análise colocalizational também é possível em fatias de tecido e outras preparações 11, no entanto os componentes de tratamento de droga e a fixação do tecido / de preparação não seria adequado.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma concessão do CIHR (MOP394808) e um Research Chair Canadá para CMCEWO foi o destinatário de uma Bolsa de Pós-Graduação do NSERC.
Materials
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps – Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2000 |
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