Een nieuwe toepassing van de elektrische Penetration Graph (EPG) voor het verwerven en het meten van elektrische signalen in Floëem Sieve Elements

Summary

Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.

Abstract

Elektrofysiologische eigenschappen van de cellen worden vaak bestudeerd in vitro, na hen te distantiëren van hun eigen omgeving. Echter, de studie van elektrische transmissie tussen verre cellen in een organisme nodig vivo-artefact vrij opnames van cellen ingebed in hun eigen omgeving. De overdracht van elektrische signalen van gewonden naar verwonde gebieden in een fabriek heeft sinds lange gewekt het belang van de botanici. Het floëem, de levende deel van de plant vasculatuur die is verspreid over de plant, is voorgesteld als een belangrijke weefsel in elektrische transmissie in planten. Het gebrek aan geschikte elektrofysiologische werkwijzen tal van uitdagingen voor de studie van de elektrische eigenschappen van het floëem cellen in vivo. Hier presenteren we een nieuwe benadering voor intracellulaire elektrofysiologie van zeef elementen (SE) dat levende luizen of andere phloem geeft Hemipteran insecten gebruikt, geïntegreerd in de elektrische penetratie graph (EPG) circuit. De veelzijdigheid, robuustheid en nauwkeurigheid van deze methode was het mogelijk om op te nemen en in detail het wond geïnduceerde elektrische signalen in SE centrale aderen van de modelplant Arabidopsis thaliana ^1. Hier laten we zien dat EPG-elektroden gemakkelijker uitvoerbaar voor intracellulaire elektrofysiologische opnames van SE's marginale aders, alsmede het vermogen van SE antwoorden met elektrische signalen naar verschillende externe stimuli bestuderen. De EPG benadering toegepast op intracellulaire electrofysiologie SE kan worden toegepast om een ​​grote verscheidenheid van plantensoorten, in een groot aantal planten / insecten combinaties, en voor veel onderzoek gericht.

Introduction

Het vermogen om interlokale elektrische signalen te produceren, is een voordelige eigenschap van meercellige organismen waarmee efficiënte reacties op externe stimuli. Dit kenmerk is onafhankelijk geëvolueerd in planten en dieren, en vormt derhalve een geval van convergerende evolutie. Aangezien de elektrische signalen zijn gekoppeld met belangrijke functies bij dieren als neurale transmissie en spiercontractie, de moleculaire basis, het overdrachtmechanisme en functies van stimulus geïnduceerde elektrische signalen bij dieren zijn onderwerp van intensief onderzoek. In tegenstelling, heeft-stimulus geïnduceerde elektrische signalering in planten weinig onderzoek aandacht gekregen. Hoewel planten geen zenuwen of spieren, lijkt er voldoende bewijs om aan te nemen dat de stimulus geïnduceerde elektrische signalen in planten spelen een belangrijke rol in hun reactie op omgevingsfactoren.

Het floëem, de levende component van de installatie vasculatuur, is voorgesteld als een belangrijke subStrate voor de overdracht van stimulus opgewekte elektrische signalen, gestimuleerde / beschadigd ongestimuleerde / onbeschadigde gebieden ^2. De belangrijkste cellen van het floëem de zeef elementen (SE), relatief eenvoudig, langgerekte cellen. De uiteinden SE zijn verbonden met andere SEs, die een continue lage weerstand, zeef buissysteem dat is verspreid over de fabriek. Er zijn echter maar weinig studies over de elektrische eigenschappen van deze zeer gespecialiseerde cellen. In deze eerdere studies, onderzoekers toegankelijk SE met ofwel glas micro-elektroden ³ of met glazen elektroden die werden gekoppeld aan planten-ingebracht stiletten van bladluizen, na stylectomy (snijden) ^4. Glas micro-elektroden zijn gemaakt uit glas capillairen die worden getrokken aan één uiteinde met warmte in dunne stift kleiner dan 1 micrometer in diameter, en vervolgens gevuld met een KCl-oplossing. Een Ag / AgCl of platina draad ingebracht in het KCl-gevulde glaselektrode wordt dan verbonden met de versterkeringang, en een referentelectrode wordt in het bad rond de cel van belang, het circuit te voltooien. Deze opstelling wordt het verschil in potentiaal tussen de extracellulaire referent elektrode en de intracellulaire meetelektrode, dwz de membraanpotentiaal van de cel ^5. Met deze methode Umrath maakte de eerste intracellulaire opname van een plantencel met de algen Nitella ^6,7. Nitella is een relatief eenvoudig organisme grote cellen, en daarom vatbaar voor intracellulaire elektrofysiologie experimenten. In tegenstelling, het inbrengen van intracellulaire glazen elektroden in de kleine cellen van meercellige, driedimensionale landplanten is technisch veeleisend, is zeer bekwaam onderzoeker, evenals geavanceerde visualisatie, micromanipulatie en anti-vibratie apparatuur. Hoewel glaselektroden geschikt opnemen van oppervlakkige cellen in planten, zoals wortel- epidermiscellen ^8, intracellulaire recordings uit cellen diep ingebed in de plant weefsel, zoals SE, zeer waarschijnlijke oorzaak-schade geïnduceerde responsen, verwarrende resultaten. In 1989, Fromm en Eschrich melding gemaakt van het gebruik van een andere methode, genaamd het "bladluis methode, waarbij glazen elektroden gekoppeld bladluis stylets na stylectomy ^4. De bladluis methode is minimaal invasieve, omdat flexibele stiletten niet leiden tot weefsel of celschade als glaselektroden doen. Bladluis stiletten zijn van de natuur geweldige uitvinding voor de plantaardige penetratie en bladluizen zijn aanzienlijk meer ervaren dan mensen in het vinden van SE. Helaas is deze bladluis methode is ook zeer veeleisend op het gebied van technische expertise en apparatuur. Bovendien is het succes van elk experiment dat deze techniek implementeert volledig afhankelijk van de bladluis zich in voedingsmodus – de stylet stabiel ingebracht in een SE ten tijde van stylectomy. Denken in retrospectief, kan men zien dat de kans op succes van deze techniek kon ik geweestETER door aan de experimentele opstelling van een instrument om de identificatie of de bladluis stilet in het SE bij de toepassing stylectomy.

In 1964, McLean en Kinsey beschreven een 'elektronische controlesysteem' voor de studie van het eetgedrag van bladluizen in real time ^9,10. In dit systeem, de bladluis en de stylet doorgedrongen plant werden opgenomen in een elektrisch circuit. Later, in 1978, Tjallingii bedacht een gemodificeerde versie van het systeem, genaamd het "Electrical Penetration Graph (EPG) -systeem ^11,12. Dat het oorspronkelijke elektronische controlesysteem was gevoelig voor de resistentie afkomstig potentialen slechts met EPG systeem, de elektromotorische kracht (EMK) afkomstig potentialen, bijvoorbeeld, geproduceerd in de fabriek of het insect zou kunnen zijn naast potentialen verband met geregistreerde weerstand (R) in het insect. Dit is een belangrijke verbetering, omdat beide signaalcomponenten, emf en R,bieden biologische relevante informatie over gebeurtenissen tijdens planten binnendringen door bladluizen. Wat de EPG voorversterker gevoelig voor de R-componenten is de relatief lage ingangsweerstand van 1 GQ, dat dicht bij het gemiddelde van de plant / luisresistentie. Een kleine offset spanning (figuur 1, V) van ongeveer 100 mV wordt op de plant, die vervolgens wordt verdeeld over planten- en insectencellen enerzijds, en de ingangsweerstand anderzijds. De spanningen en hun veranderingen worden gemeten op een punt (figuur 1 A, B) tussen het insect en de ingangsweerstand. Daarom is de R-componenten vertegenwoordigen fabriek-luisresistentie modulaties van de offset spanning, terwijl de EMF-componenten zijn een bepaalde fractie van plantaardige potentials aan de stilet tip en mogelijkheden als gevolg van de insecten. De plant potentials – het meest relevant hier – zijn vooral membraanpotentialen van de plantencellen doorboord door de bladluis stiletten. Het insect potentialen lijken vooralstreaming potentials veroorzaakt door vloeiende bewegingen binnen de twee stylet kanalen, dat wil zeggen, het eten en de speekselklieren kanalen; geen interne zenuw of spier potentials worden opgenomen in de EPG. In de praktijk is de stilet punt functioneert als een elektrode. Alle plantencellen negatief geladen in ten opzichte van de positieve buitenkant van de cel. De elektrische stroom (dat wil zeggen, de beweging van geladen ionen in waterige oplossing) stroomt van binnen naar buiten en vice versa is zeer beperkt vanwege de hoge weerstand van het celmembraan. Normaal wordt de rustpotentiaal wordt constant gehouden. Echter, wanneer negatieve ionen verhuizen of positieve ionen bewegen door het celmembraan, wordt de membraanpotentiaal af, daarom, het depolariseert. Depolarisatie treedt op bij cel excitatie. Ionen bewegen dan in of uit wanneer specifieke ionkanalen in het membraan worden geopend of wanneer het membraan beschadigd is en ionen lekken in en uit. Alle cellen hebben ionenkanalen en pompen in tHij plasmamembraan dat de membraanpotentiaal zijn rustniveau meenemen herstel van de oorspronkelijke concentratie van verschillende ionen in de cel. De rustpotentiaal en de veranderingen emf onderdelen, en derhalve de EPG techniek is geschikt om deze te meten.

Figuur 1. EPG-elektroden. De EPG-elektrode is een levende bladluis geïntegreerd in de elektrische Penetration Graph (EPG) circuit, waarvan stilet in een zeef element (SE) in stabiele voeding modus wordt geplaatst. Indien het stilet gespietst SE in rust (paneel A), de spanning in het circuit opgenomen door EPG, stabiel en op rustpotentiaal niveau (Paneel C, Rest). Indien de SE wordt bekrachtigd, het membraan depolariseert (panel B), die wordt gevisualiseerd in de EPG een geleidelijke verhoging van de spanning (paneel C, depolarisatie). Aangezien de ionenbalans in de SE terug te rusten, dat wil zeggen het repolarizes, de spanning opgenomen door EPG geleidelijk af naar de rest potentiële niveau (Panel C, repolarisatie). In paneel C, "A" en "B" verwijzen naar de in panelen A en B, respectievelijk scenario. V = Instelbare offset spanningsbron. Ri = Input weerstand. Parallel aan de 1 GQ externe weerstand, de versterker een inwendige (in de OpAmp) 1,5 TΩ hoge weerstand (kaders A en B, in grijs). Met de afstandsbediening van de schakelaar de EPG pre-amp kan worden veranderd van normaal tot, die het mogelijk maakt het verkrijgen van zeer nauwkeurige spanning waarden-modus EMF. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In de volgende paragraaf geven we de lezer met een eenvoudige protocol voor het uitvoeren van EPG experimenten dat geldig is voor zowel insecten-gericht en plant gerichte studies.

Protocol

1. Bladluis Rearing Opmerking: De keuze van de planten en bladluissoorten voor EPG opnames afhankelijk van het onderzoeksdoel. Voor studies op Arabidopsis thaliana, de bladluis melige koolluis geschikt is. Achter B. brassicae bladluizen in een kas Brassica oleracea. Houd de planten die voor bladluis fokken in kooien om verontreinigd andere planten. Keep-bladluis fokken van planten en experimentele installaties (in ons geval B. oleracea …

Representative Results

In een eerdere studie hebben we geïmplementeerd EPG-elektrode techniek met als doel het karakteriseren van de elektrische signalen die in SE van de middennerf tijdens rups attack 1. De middennerf is een geprefereerde insertieplaats conventionele glazen elektroden, alsook voor glas-stylet elektroden, omdat het SE-dichtheid en relatief robuust dus ontvankelijk voor de fixatie op bij het implementeren van deze technieken. Hier hebben we gebruik van de veelzijdigheid van de EPG elektrode met als doel het verzame…

Discussion

Dit artikel geeft een gedetailleerd protocol voor het maken van elektrische Penetratie Graph (EPG) opnames. De EPG techniek is goed ingeburgerd, met 100-200 actieve gebruikers wereldwijd, en het is geïmplementeerd voor veel studies over verschillende onderwerpen, bijvoorbeeld: a) waardplant resistentie tegen bladluizen en andere stylet dragende insecten ^13; b) planten virus en ziekteverwekker transmissie mechanismen ^14; c) insecticide werkingsmechanisme, (toxiciteit en gedragsveranderingen) ^1…

Materials

Brass connector pins	EPG Systems/hardw.shop		Φ 1.2 mm
Thin copper wire	EPG Systems/hardw.shop		approx. Φ 0.2 mm
Thin gold wire	EPG Systems		Φ 18 µm
Soldering fluid	hardware shop		matching the soldering wire
Resin-cored soldering wire	hardware shop
Styrofoam	any
Water-based silver glue	EPG systems		recipe in: www.epgsystems.eu
Paper wipes	Kimberly-Clark	5511
Soldering bolt	any
Stereomicroscope	Hund Wetzlar		minimum magnification is x10
Small scissors	Fine Science Tools	14088-10
Scalpel	Fine Science Tools	10050-00
Fine forceps	Fine Science Tools	11231-20
Vortex	A. Hartenstein	L46
Watercolor brushes	any		Number 1 or 2
Air suction device			see description in: www.epgsystems.eu
Insect pins	any		No. 1 or 2
Solid table
Faraday cage			Hand made
Computer	Fujitsu Siemens
Data acquisition software	EPG Systems		Stylet+d
Giga-4 (-8) Complete System	EPG Systems
includes the following:
Main control box with USB output		Di155/Di710	12/14 bit, rate 100Hz(softw. fixed)
EPG probes 4 (8)			50x DC pre-amplifier
Swivel clamps on rod
DC power adaptor			bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC
Plant electrodes and cables
Additional test and ground cables