Génération de Recombinant Human IgG anticorps monoclonaux à partir de cellules immortalisées Classé B
Summary
Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.
Abstract
Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.
Introduction
Le but de cet article est de décrire en détail une méthodologie pour générer et caractériser des anticorps monoclonaux IgG humaines obtenues à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (CMSP) humaines.
L'intérêt d'étudier des anticorps humains a augmenté dans de nombreux domaines de recherche. En particulier, de nombreux groupes de recherche sont intéressés à la pathologie causée par des auto-anticorps 1-3. Nous avons cloné et caractérisé pathogènes auto-anticorps 1. L'étude d'auto-anticorps peut aider à identifier leurs objectifs et d'élaborer des stratégies thérapeutiques, par exemple, en utilisant des anticorps concurrents 4. En outre, l'étude d'anticorps humains peut aussi être d'intérêt dans d'autres domaines de la recherche, à savoir, pour évaluer la réponse immunitaire après la vaccination 5, pour caractériser le profil d'anticorps d'individus qui ont été exposés et qui sont devenus résistants aux pathogènes spécifiques 6 ou pour étudier ce qui anticorps sont enle répertoire naturel 7,12.
Plusieurs techniques ont été développées pour produire des anticorps monoclonaux humains recombinants 12/08; la plupart d'entre eux utilisent phage display et l'immortalisation des cellules B. L'utilisation de la présentation par des phages a été largement appliquée pour la découverte de nouveaux anticorps 13. Cependant, il présente un inconvénient majeur, à savoir que les paires de chaînes lourdes et légères de l'immunoglobuline humaine devenue dissociés dans le processus. Production d'hybridomes à cellules B humaines ou de transformation EBV remédie à cet inconvénient.
Nous utilisons l'infection des cellules thymiques B par l'EBV en combinaison avec une stimulation cellulaire polyclonale B par l'intermédiaire des récepteurs Toll-like 9 (TLR-9) 6,12.
Dans cet article, nous décrivons en détail la technologie que nous utilisons pour le développement d'anticorps humains IgG, avec un aperçu complet de toutes les étapes de l'isolement de la CMSP vitro génération d'anticorps. Cetteprotocole peut être utilisé pour l'analyse de tout type de profil IgG humaine. Dans notre laboratoire, les cellules B produisant des anticorps IgG ont été séparés avec succès à partir du reste de PBMC après triage. Cinquante cellules B trié 8 peuvent ensuite être étalées dans des plaques multi-puits et immortalisées par EBV et TLR-9 activation, de l'expansion clonale de cellules B individuelles. Comme cellules nourricières, les fibroblastes provenant de tissu de poumon embryonnaire humain ont été utilisées, WI38 de lignées cellulaires, ce qui facilite la visualisation des cellules B immortalisées. A partir de ces cellules B, les séquences des chaînes lourdes et légères de l'immunoglobuline peuvent être obtenues par PCR, et les gènes d'anticorps clones dans immunoglobuline G vecteurs d'expression et produites in vitro. Grâce à cette technique, les anticorps simples avec exactement la même séquence anticorps trouvés chez le donneur peuvent être étudiés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce manuscrit, toutes les étapes de la production d'anticorps IgG à partir de PBMC humaines sont présentés en détail. Ce protocole comprend certains avantages par rapport aux techniques déjà publiés. L'un des avantages est que l'anticorps produit conserve les chaînes lourdes et légères correspondant à la paire initiale dans le clone de cellule B. L'identification des anticorps IgG peut être effectué dans tout type de donneur humain, et il n'y a pas besoin d'exacerbation de la r?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Contrat de recherche Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) à (GN-G.). Bourse de l'Organisation néerlandaise pour la recherche "Graduate School of Neuroscience Program translationnelle" scientifique (022005019) à (CH).
Les subventions du Fonds Prinses Beatrix (Projet WAR08-12) et l'Association Française contre les Myopathies à (PM-M.); ainsi que par un Veni Communauté de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (916.10.148) une bourse de la Fondation du cerveau des Pays-Bas (FS2008 (1) -28) et le Prinses Beatrix Fonds (Projet WAR08-12) (à ML ).
Nous remercions Jozien Jaspers pour son aide dans le B-tri cellulaire par cytométrie de flux.
Materials
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | solution containing polysucrose and sodium diatrizoate |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | ||
| 96 U-bottom micro well plates | Costar | 3799 | |
| Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco, Life Technologies | 12633-020 | |
| 30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line | ATCC | CRL-1612 | 3.4 x 108 copies/ml |
| CpG2006 | Invivogen | ODN 7909 | |
| Wi38 cells | Sigma-Aldrich | 90020107 | |
| Interleukin-2 | Roche | 10799068001 | |
| ELISA plates | Greiner Bio-One, Microlon | 655092 | |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-008 | |
| 4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker) | Biorad | 170-6404 | |
| Human IgG | Sigma | I 2511 | HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml |
| Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) | Jackson ImmunoResearch | 109-036-008 | |
| ELISA reader (Perkin Elmer 2030) | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
| Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ | Jackson ImmunoResearch | 309-035-095 | |
| SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System | Invitrogen | 18080-200 | |
| Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 | Applied Biosystems | ||
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Reverse transcription system kit | Promega | A3500 | |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | TAKARA | R001A | |
| Primers (2μl) | Sigma | ||
| Ultrapure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 100 bp ladder | Invitrogen | 15628-019 | |
| Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) | Biorad | 170-8100 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| 0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Genetic analyser ABI300 | Applied Biosystems | 4346906 | |
| DH5α competent cells (E. coli) | Invitrogen | 18263-012 | |
| pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp) | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
| pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp) | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
| pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
| pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
| SOC medium | Invitrogen | 15544-034 | |
| LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) | Invivogen | fas-zn-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) | Invivogen | fas-zn-l | |
| DNA Miniprep kit | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
| Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) | Nanodrop | ||
| LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) | Invivogen | fas-bl-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) | Invivogen | fas-bl-l | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1 |
| 2-Log DNA ladder | New England Biolabs | N3200S | 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml |
| XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1 |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | 1 U/µL, in 10x FastAP Buffer |
| DH5α competent cells | Invitrogen | 18263-012 | |
| PE Mouse Anti-Human IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
| anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 | Fisher scientific | BDB563942 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| BigDye Terminator v3.1 | Applied Biosystems | 4337455 |
Riferimenti
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