-16 RRNA लक्ष्य निर्धारण एक Digoxin लेबल डीएनए जांच का उपयोग आयल एम्बेडेड ऊतकों के भीतर जीवाणुओं की सीटू का पता लगाने में
Summary
Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Abstract
The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Introduction
जीवाणु ऐसे periodontitis, pulpitis, pericoronitis, cellulitis, और अस्थिमज्जा का प्रदाह के रूप में विभिन्न मौखिक रोगों के एटियलजि में एक भूमिका निभाते हैं। रोग के रोगजनन में जीवाणुओं की भूमिका को समझने के लिए और उपचार के प्रभाव पर नजर रखने के क्रम में, ऊतक के भीतर बैक्टीरिया के स्थानीयकरण महत्वपूर्ण है। periodontitis के साथ रोगियों से मसूड़े ऊतक के भीतर बैक्टीरिया की उपस्थिति एक fluorescence- का उपयोग करते हुए सीटू संकरण (मछली) 8 में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 1,2, immunohistochemistry और इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर बैक्टीरिया विशिष्ट एंटीबॉडी 3-7, और फ्लोरोसेंट सहित विभिन्न तरीकों का उपयोग कर दिखाया गया है -16 rRNA को लक्षित में लेबल oligonucleotide जांच। फिर भी, इन तरीकों में व्यापक रूप से की वजह से तकनीकी सीमा या कठिनाइयों के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं। एंटीबॉडी के साथ तुलना में, -16 rRNA को लक्षित कर जांच के लिए उत्पादन और प्रजाति विशिष्टता प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं। मछली BACT के दृश्य के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण साबित हो गया हैऐसे पट्टिका बायोफिल्म के रूप में उनके प्राकृतिक वातावरण में eria। हालांकि, ऊतकों के नमूनों के लिए मछली के आवेदन की वजह से विभिन्न ऊतकों के घटकों के autofluorescence तक सीमित है। वे 9 खून बह शामिल करते हैं, उदाहरण के लिए, लाल रक्त कोशिकाओं की मजबूत autofluorescence अक्सर सूजन के ऊतकों को प्रतिदीप्ति प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग बाधित।
सूजन मसूड़ों के ऊतकों के भीतर बैक्टीरिया स्थानीयकरण करने के लिए आदेश में, इसलिए, एक digoxigenin का उपयोग कर एक बगल में संकरण विधि (डीआईजी) लेबल डीएनए जांच विकसित किया गया है और सफलतापूर्वक 10,11 लागू होता है। पी का उपयोग कर आयल एम्बेडेड ऊतकों के भीतर बैक्टीरिया के स्थानीयकरण के लिए यहाँ एक विस्तृत प्रोटोकॉल gingivalis -specific और सार्वभौमिक eubacterial जांच वर्णित किया गया है। यह विशेष रूप से इसी तरह के परिणाम अन्य प्रयोगशालाओं में reproduced किया जा सकता है, ताकि विधि का मानकीकरण पर केंद्रित है। इस प्रोटोकॉल उनके ऊतकीय संदर्भ और resu के भीतर बैक्टीरिया का स्थानीयकरण की अनुमति देता हैएलटीएस अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं। वर्णित प्रोटोकॉल या तो विभिन्न ऊतकों में एक प्रजाति-विशेष या सार्वभौमिक तरीके से बैक्टीरिया स्थानीयकरण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यूनिवर्सल जांच polymicrobial रोगों में बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए और विशिष्ट जीवाणुओं की भूमिका नहीं जाना जाता है, जहां रोगों में बैक्टीरिया का एक संभावित भूमिका का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है एक डीआईजी लेबल डीएनए जांच का उपयोग आयल एम्बेडेड ऊतकों के भीतर बैक्टीरिया स्थानीय बनाना। जांच बैक्टीरियल -16 RRNA जीन के डीएनए या आरएनए अणुओं को लक्षित करता है, और -16 rRNA-?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन से अनुदान (2013R1A1A3005669) और कोरियाई स्वास्थ्य प्रौद्योगिकी अनुसंधान एवं विकास परियोजना, स्वास्थ्य और कल्याण मंत्रालय के एक अनुदान (HI13C0016) द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
Riferimenti
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