Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Bakterier spiller en rolle i etiologien av forskjellige orale sykdommer så som periodontitt, pulpitt, perikoronitt, cellulitt, og osteomyelitt. For å forstå rollen til bakterier i patogenesen av sykdom og for å overvåke effekten av behandlinger, er lokaliseringen av bakterier i vevet viktig. Nærvær av bakterier i gingival vev fra pasienter med periodontitt har blitt vist ved hjelp av forskjellige metoder, inkludert elektronmikroskopi 1,2, immunohistokjemi og immunfluorescens ved å bruke bakterie spesifikke antistoffer 3-7 og fluorescerende in situ hybridisering (FISH) 8 ved hjelp av en fluorescence- merket oligonukleotidprobe målretting 16S rRNA. Likevel er disse metodene ikke mye brukt på grunn av tekniske begrensninger eller vanskeligheter. Sammenlignet med antistoffer, sonder målretting 16S rRNA er enkle å produsere og oppnå arts spesifisitet. FISH har vist seg å være et utmerket verktøy for visualisering av bacteria i sine naturlige miljøer som plakk biofilm. Imidlertid, anvendelse av fisk til vevsprøver er begrenset på grunn av forskjellige autofluorescens vevskomponenter. For eksempel, den sterke autofluorescens av røde blodceller hemmer ofte anvendelse av fluorescens-teknologi for å betent vev når de involverer blødning 9.
For å lokalisere bakterier i betente gingivale vev, og derfor en in situ-hybridisering ved anvendelse av en digoksigenin (DIG) -merket DNA-probe er blitt utviklet og anvendt med suksess 10,11. Her en detaljert protokoll for lokalisering av bakterier i parafininnstøpte vev ved bruk av P. gingivalis-spesifikke og universelle eubakterielle onder har blitt beskrevet. Det er spesielt fokusert på standardisering av metoden, slik at lignende resultater kan reproduseres i andre laboratorier. Denne protokollen tillater lokalisering av bakterier innenfor deres histologisk kontekst og results er reproduserbar. Den beskrevne protokoll kan benyttes for å lokalisere bakteriene enten i en artsspesifikk eller universell måte i forskjellige vev. Den universelle probe er spesielt nyttig for å påvise bakterier i polymikrobielle sykdommer og for å undersøke en mulig rolle av bakterier i sykdommer hvor rollen til spesifikke bakterier er ikke kjent.
Her en protokoll for å lokalisere bakterier i parafininnstøpte vev ved bruk av et DIG-merket DNA-probe er blitt beskrevet. Sonden retter seg mot det DNA- eller RNA-molekyler av bakterielle 16S rRNA-genet, og 16S rRNA-målretting prober kan utformes enten som artsspesifikk eller universell. Den spesifikke hybridisering av P. gingivalis -spesifikk sonde til P. gingivalis, men ikke til andre orale bakterier er tidligere vist 10. I motsetning til dette, det eubakterielle probe hybridisert til …
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av en bevilgning (2013R1A1A3005669) fra National Research Foundation of Korea og stipend (HI13C0016) av den koreanske Health Technology R & D Project, Ministry of Health & Welfare.
Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
DEPC | Sigma | P159220 | |
DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
Formamide | Sigma | F9037 | |
ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
Levamisole | Vector | SP-5000 | |
Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
Maleic acid | Sigma | M0375 | |
Methyl green | Sigma | M6776 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
Permount | Fisher | SP15-500 | |
Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
Tris-HCl | Research organics | 3098T |