A detecção in situ de bactérias dentro dos tecidos de parafina-encaixados Usando um marcado com Digoxina DNA Probe Segmentação 16S rRNA

Summary

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Abstract

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Introduction

As bactérias desempenham um papel na etiologia de diversas doenças orais, tais como periodontite, pulpite, pericoronite, celulite, osteomielite e. A fim de compreender o papel das bactérias na patogénese da doença e para monitorizar o efeito de tratamentos, localização de bactérias dentro do tecido é importante. A presença de bactérias no interior do tecido gengival a partir de pacientes com periodontite foi demonstrado usando vários métodos, incluindo microscopia electrónica de ^1,2, imuno-histoquímica e imunofluorescência utilizando anticorpos específicos para cada bactéria ^3-7, e hibridação in situ fluorescente (FISH) ⁸ utilizando um fluorescence- sonda oligonucleotídica marcada segmentação 16S rRNA. No entanto, estes métodos não são amplamente utilizados devido a limitações técnicas ou dificuldades. Comparado com os anticorpos, as sondas alvo rRNA 16S são fáceis de produzir e alcançar espécie-especificidade. FISH tem provado ser uma excelente ferramenta para a visualização de bactériaeria em seus ambientes naturais, como biofilme placa. No entanto, a aplicação de FISH para amostras de tecidos é limitado devido a autofluorescência de vários componentes do tecido. Por exemplo, o forte autofluorescência das células vermelhas do sangue, muitas vezes dificulta a aplicação da tecnologia de fluorescência para tecidos inflamados quando elas envolvem sangramento ^9.

De forma a localizar as bactérias dentro dos tecidos gengivais inflamadas, por conseguinte, um método de hibridação in situ, utilizando uma digoxigenina (DIG) sonda de DNA marcado com foi desenvolvido e aplicado com sucesso ^10,11. Aqui, um protocolo detalhado para a localização de bactérias no interior de tecidos embebidos em parafina, utilizando P. gingivalis sondas eubacterianas espec�icos e universais tem sido descrita. É particularmente focado na padronização do método de modo que resultados semelhantes podem ser reproduzidos em outros laboratórios. Este protocolo permite a localização de bactérias dentro de seu contexto histológica e do results são altamente reprodutível. O protocolo descrito pode ser utilizado para localizar bactérias ou de uma forma específica para a espécie ou universal em diversos tecidos. A sonda universal é especialmente útil para detectar bactérias em doenças polimicrobianas e para estudar o potencial papel da bactéria, em doenças em que o papel de bactérias específicas que não é conhecido.

Protocol

1. Preparação Probe A amplificação por PCR da sonda Para o P. sonda gingivalis -específica, amplificar um fragmento de DNA 343-bp do P. gingivalis 16S rRNA por PCR utilizando o DNA genómico de P. gingivalis e os seguintes iniciadores: 5'TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'e 5' AGIR CGT ATC CGT TAT GCC TC-3 '10. Realizar amplificações com as seguintes condições de ciclos: 35 ciclos a 95 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 30 seg, e 72…

Representative Results

A Figura 1 mostra dot blot de sondas marcada com DIG em comparação com a sonda de controlo positivo fornecido com o kit para determinar a sua sensibilidade. A 343 pb P. sonda espec�ico gingivalis é de 25 vezes mais sensível do que a sonda eubacteriana 70 pb. A Figura 2 mostra a hibridização in situ de tecidos gengivais obtidos a partir de pacientes com periodontite crónica para a detecção de P. gingivalis e eubactérias. Os sinais bacter…

Discussion

Aqui um protocolo para localizar bactérias dentro dos tecidos embebidos em parafina, utilizando uma sonda de DNA marcada com DIG tem sido descrita. A sonda tem como alvo as moléculas de ADN ou ARN do gene 16S do rRNA bacteriano, e as sondas de rRNA 16S-alvo pode ser concebido como uma ou outra espécie específica, ou universal. A hibridação específica da P. gingivalis espec�ico sonda para P. gingivalis, mas não a outras bactérias orais tem sido mostrado previamente ^10. Em contra…

Materials

Acetic anhydride	Sigma	6404
50% Dextran sulfate solution	Millipore	S4030
50X Denhardt’s solution	Sigma	D2532
DEPC	Sigma	P159220
DIG DNA labeling and detection kit	Roche	11 093 657 910
Formamide	Sigma	F9037
ImmEdge™ Pen	Dako	H-400
Levamisole	Vector	SP-5000
Magnesium chloride	Sigma	246964
Maleic acid	Sigma	M0375
Methyl green	Sigma	M6776
Paraformaldehyde	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
Salmon sperm DNA solution	Invitrogen	#15632-011
Sodium chloride	Sigma	S9625
Sodium citrate	Duksan	D1420
Sodium dodecyl sulfate	Amresco	227
Triethanolamine-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Research organics	3098T