La detección in situ de las bacterias dentro de los tejidos embebidos en parafina utilizando un ADN sonda digoxina marcada focalización 16S rRNA
Summary
Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Abstract
The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Introduction
Las bacterias desempeñan un papel en la etiología de diversas enfermedades orales tales como periodontitis, pulpitis, pericoronitis, celulitis, y osteomielitis. Con el fin de comprender el papel de las bacterias en la patogénesis de la enfermedad y para controlar el efecto de los tratamientos, la localización de las bacterias dentro del tejido es importante. La presencia de bacterias en el tejido gingival de pacientes con periodontitis se ha demostrado usando varios métodos, incluyendo microscopía electrónica de 1,2, inmunohistoquímica e inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos de bacterias 3-7, y la hibridación fluorescente in situ (FISH) usando un 8 por fluorescencia sonda de oligonucleótido marcada orientación 16S rRNA. Sin embargo, estos métodos no son ampliamente utilizados debido a la limitación técnica o dificultades. En comparación con anticuerpos, sondas dirigidas a 16S rRNA son fáciles de producir y lograr especificidad de especie. FISH ha demostrado ser una excelente herramienta para la visualización de bacteria en sus entornos naturales como el biofilm de la placa. Sin embargo, la aplicación de FISH a las muestras de tejido es limitado debido a la autofluorescencia de los diversos componentes del tejido. Por ejemplo, el fuerte autofluorescencia de las células rojas de la sangre a menudo dificulta la aplicación de la tecnología de fluorescencia para los tejidos inflamados cuando implican sangrado 9.
Con el fin de localizar las bacterias dentro de los tejidos gingivales inflamados, por lo tanto, un método de hibridación in situ utilizando un digoxigenina (DIG) sonda de ADN marcada con se ha desarrollado y aplicado con éxito 10,11. Aquí un protocolo detallado para la localización de las bacterias dentro de los tejidos incluidos en parafina utilizando P. gingivalis sondas específicos de eubacterial y universales se ha descrito. Se centra sobre todo en la estandarización del método de manera que resultados similares se pueden reproducir en otros laboratorios. Este protocolo permite la localización de las bacterias dentro de su contexto histológico y el results son altamente reproducible. El protocolo descrito se puede utilizar para localizar las bacterias ya sea de una manera específica de la especie o universal en varios tejidos. La sonda universal es especialmente útil para detectar bacterias en enfermedades polimicrobianas y para estudiar un posible papel de las bacterias en enfermedades en las que no se conoce el papel de las bacterias específicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí un protocolo para localizar las bacterias dentro de los tejidos embebidos en parafina utilizando una sonda de ADN marcada con DIG que se ha descrito. La sonda se dirige a las moléculas de ADN o ARN de origen bacteriano gen 16S rRNA, y las sondas de ARNr 16S-direccionamiento puede ser diseñado como cualquiera de las especies-específico o universal. La hibridación específica de la P. sonda específico de gingivalis a P. gingivalis pero no a otras bacterias orales se ha demostrado prev…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por una beca (2013R1A1A3005669) de la Fundación Nacional de Investigación de Corea y una subvención (HI13C0016) de la coreana Salud Tecnología Proyecto I + D del Ministerio de Salud y Bienestar Social.
Materials
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
Riferimenti
- Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis. J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).
- Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).
- Saglie, F. R., et al. The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria. J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).
- Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies. J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).
- Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva. J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).
- Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
- Marttila, E., et al. Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis. J. Oral Microbiol. 6, (2014).
- Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization. J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).
- Abrams, K., Caton, J., Polson, A. Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding. J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).
- Kim, Y. C., et al. Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis. Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).
- Choi, Y. S., et al. Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers. Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions. J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).
- Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).
- Hajishengallis, G., et al. A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Axon, A. Gastric cancer and Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).
- Fenhalls, G., et al. In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).
