على قناة واحدة وتحليل الكالسيوم التصوير في Podocytes من الكبيبات المعزولة حديثا
Summary
Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.
Abstract
Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.
Introduction
الكلى الحفاظ على التوازن استتبابي للمواد المختلفة وتنظيم حجم الدم في الطريقة التي يحدد مجموع ضغط الدم. الاضطرابات في الترشيح الكلوي، استيعاب أو إفراز الرصاص أو مرافقة الحالات المرضية، التي تتراوح بين المفرط أو انخفاض ضغط الدم لإنهاء مرحلة المرض الكلوي الذي يتطلب في نهاية المطاف زرع الكلى. وحدة تصفية الكلى (الكبيبة) ويتكون من ثلاث طبقات – البطانة الشعرية، الغشاء القاعدي وطبقة خلية واحدة من الخلايا الطلائية – podocytes، والتي تلعب دورا رئيسيا في الحفاظ على سلامة شق الحجاب الحاجز وظيفة 1. الخلل في تصفية الكبيبي permselective يسبب فقدان البولية من الجزيئات، مثل بروتينية. عوامل مختلفة قد تؤثر على هيكل podocytes والعمليات أقدامهم، والتي تحدد على سلامة حاجز الترشيح الكبيبات.
وتشارك podocytes في الحفاظ على يسرقeruli ظيفة الترشيح. وقد ثبت أن تناول الكالسيوم غير لائق من قبل خلية رجلاء يؤدي إلى إصابة الخلايا ويلعب دورا هاما في تطور مختلف أشكال nephropathies 2،3. لذلك، ووضع نموذج الذي يسمح للقياس المباشر للتغيرات تركيز الكالسيوم داخل الخلايا سوف يكون مفيدا للدراسات وظيفة خلية رجلاء. تم الكبيبات معزولة تستخدم سابقا في العديد من الدراسات بما في ذلك قياس معامل الانعكاس الألبومين يغير 4 و تقييم التيارات الخلوية المتكاملة في خلية كاملة الكهربية القياسات التصحيح، المشبك 5،6. في هذه الورقة وصفنا البروتوكول الذي يسمح الباحث لقياس التغيرات تركيز الكالسيوم داخل الخلايا استجابة لطلبات من وكلاء الدوائية، وتقدير مستويات القاعدية من الكالسيوم داخل الخلايا، وتقييم النشاط الفردي قنوات الكالسيوم. قياسات تركيز الكالسيوم Ratometric والتصحيح، المشبك electropاستخدمت hysiology لتحديد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا ضمن النشاط خلية رجلاء وقناة، على التوالي.
Protocol
Representative Results
Discussion
النهج وصفها هنا يسمح لتحليل التعامل مع الكالسيوم من قبل podocytes من الكبيبات القوارض. هذا الأسلوب يسمح تطبيق التصحيح، المشبك الكهربية واحد قناة ومضان التصوير متحد البؤر ratiometric. ومع ذلك، كلا النهجين يمكن استخدامها بشكل منفصل، من تلقاء نفسها. البروتوكول المقترح عدة خطوات…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر غلين سلوكم (كلية الطب في ويسكونسن) وكولين A. لافين (نيكون الآلات، وشركة) للحصول على المساعدة الفنية ممتازة مع التجارب المجهري. ومن المسلم به غريغوري بلاس لتصحيح التجارب المطبعية نقدية للمخطوطة. وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للHL108880 منحة الصحة وجمعية السكري الأميركية منح 1-15-BS-172 (إلى AS)، وJ. زمالة بن Lipps البحوث من الجمعية الأمريكية لأمراض الكلى (لDVI).
Materials
| Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
| FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
| Tube rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | Germany |
| Nikon confocal microscope (inverted) | Nikon | Nikon A1R | Laser exitation 488nm. Emission filters 500-550nm and 570-620nm |
| Objective | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | Silicone Compound | |
| Software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 | |
| Iberiotoxin | Sigma | I5904-5UG | |
| Niflumic acid | Sigma-Aldrich | N0630 | |
| DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
| TEA chloride | Tocris | T2265 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | without antibiotics |
| BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | 30% albumin solution |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Steel sieves: | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
| mesh 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | screen for CD-1 |
| Binocular microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Binocular microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
Riferimenti
- Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
- Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).
- Patrakka, J., Tryggvason, K. New insights into the role of podocytes in proteinuria. Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).
- Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli. J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).
- Gloy, J., et al. Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat. J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).
- Nitschke, R., et al. Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus. Kidney Int. 57, 41-49 (2000).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals. Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).
- Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome. Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).
- Abramowitz, J., Birnbaumer, L. Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels). FASEB J. 23, 297-328 (2009).
- Heeringa, S. F., et al. A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS. PLoS ONE. 4, e7771 (2009).
- Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats. Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).
- Bohrer, M. P., et al. Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules. J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).
- Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats. Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).
- Schiessl, I. M., Castrop, H. Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study. Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).
- Peti-Peterdi, J. Calcium wave of tubuloglomerular feedback. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).
- Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).
- Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).
- Schaldecker, T., et al. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).
- Roshanravan, H., Dryer, S. E. ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).
- Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species. J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).
