This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.
Detta protokoll beskriver hur man tillfälligt och distans tysta neuronal aktivitet i diskreta hjärnregioner medan djur är engagerade i inlärnings- och minnesuppgifter. Tillvägagångssättet kombinerar farmakogenetik (Designer-receptorer-Exklusivt-aktiverad-by-Designer-droger) med en beteendevetenskaplig paradigm (sensorisk prekonditionering) som är utformad för att skilja mellan olika former av lärande. Närmare bestämt är viralt medierad leverans används för att uttrycka en genetiskt modifierad hämmande G-proteinkopplad receptor (Designer Receptor) till en diskret hjärnregion hos gnagare. Tre veckor senare, när designer receptorexpressionsnivåerna är höga, är en farmakologiskt medel (Designer Drug) administreras system 30 minuter före ett visst beteende session. Drogen har affinitet för designern receptom och sålunda resulterar i hämning av neuroner som uttrycker formgivaren receptom, men är i övrigt biologiskt inert. Hjärnan regionen förblir tystas för 2-5 timmar (depending på dos och administreringssätt). Efter avslutad beteende paradigmet, är hjärnvävnad bedömas för korrekt placering och receptoruttryck. Detta tillvägagångssätt är särskilt användbart för att bestämma bidraget från enskilda hjärnregioner till specifika komponenter i beteende och kan användas över valfritt antal beteende paradigm.
En spännande utmaning inom området beteende neurovetenskap är att fastställa de neurala substrat av komplexa beteenden. Ett antal tekniker såsom permanenta skador, tillfälliga hjärninaktive via kanyler implantat och optogenetik har använts för att identifiera bidragen från diskreta hjärnregioner för delkomponenterna i komplexa beteenden. Även om dessa metoder informera vår förståelse av regional selektivitet under lärande, är varje teknik inte utan begränsningar. Närmare bestämt är permanenta skador typiskt före beteendetestning, alltså deras effekter är närvarande under hela paradigm. Kanyle studier som involverar presentationen av en kortsiktig neurala inaktivator (t.ex. tetrodotoxin) kan producera betydande skada på hjärnvävnaden och kan framkalla stress i ämnen strax före beteendetestning. Vidare är inaktivering genom kanylering begränsas till området av vävnad som omgerspetsen av kanyler. Slutligen, medan optogenetik erbjuder ett utbud av flexibilitet för den tidsmässiga kontroll av verksamheten i specifika delar av hjärnan, är det kostnadseffektivt oöverkomliga och tekniskt krävande.
Dessa begränsningar kan övervinnas med hjälp av en farmakogen metod (Designer-receptorer-exklusivt aktiverade-by-Designer-droger, DREADDs) 1,2. Viktigt medan begreppet farmakogenetik är sofistikerad, är utförandet av tekniken okomplicerad. Liknar traditionella stereotaktiska kirurgiska metoder som involverar infusion av toxin (t.ex. NMDA, ibotensyra) i diskreta hjärnregioner, innebär denna teknik infusion en adeno-associerat virus (AAV) som innehåller ett DNA-fragment för en modifierad hämmande G-proteinkopplad receptor (hM4Di; designern receptorn) i det intressanta området av standard laboratoriegnagare (se figur 1). Den virala vektorn innehåller också en fluorescerande reporter (mcitrine). Som införlivats itill celler, är formgivaren receptorn (och rapportörprotein) maximalt uttryckt ~ 3 veckor efter infusion och kan selektivt aktiveras för 2-5 h genom systemisk administrering av den annars biologiskt inert designern drogen, klozapin-N-oxid (CNO) 1 , 3. Eftersom försöks är utrustad med exakt, men fjärrtemporal kontroll över neural aktivitet i specifika delar av hjärnan, kombinerar farma särskilt väl med beteende paradigm som genomförs i flera faser. I det här exemplet, att bidraget från retrosplenial cortex (RSC) stimulus-stimulus lärande jämfört med dess roll i Pavlovsk lärande, men denna kombination av metoder är väl lämpad för ett obegränsat antal frågor som syftar till att identifiera hur specifika hjärnregioner bidrar till komplext beteende.
Dessutom, även om de inte beskrivs i det nuvarande protokollet, virala och transgena metoder kan användas för att uppnå celltyp-specifik DREADD uttryck 2. Som jaginneboende i beteende paradigm som involverar farmakologiska och / eller andra typer av experimentella manipulationer, noggrann genomgång av experimentell design och efterföljande kvantitativ analys krävs vid användning av DREADD tillvägagångssätt. Praktiker nya till DREADD tillvägagångssätt hänvisas till en omfattande översyn av nuvarande DREADD teknik 2.
Varje dag, organismer lära sig om nya stimulanser och händelser och deras relationer till varandra. Även i en bekant miljö, såsom hem, är en snabb att upptäcka förändringar i relationerna mellan stimuli eftersom dessa förändringar kan vara prediktiva för meningsfulla händelser. En sådan stimulans-stimulus (dvs, relations) innebär lärandet conjoining av flera stimuli och har traditionellt förknippats med hippocampus, som är bosatt centralt inom mediala tinningloben 4. Men inte existerar hippocampus eller agera på egen hand; kortikala regioner både inom och utanförsidan av mediala temporalloben ge kritisk sensorisk information till hippocampusformationen 5-7. Traditionella permanenta skade studier ger övertygande bevis för inblandning av ett antal kortikala regioner (t.ex. de retrosplenial, postrhinal och entorhinal cortex) i hippocampus beroende lärande, men är begränsade i sin förmåga att urskilja vilken roll en viss region under diskreta faser av learning 8-10.
Den nuvarande protokollet testar hypotesen att RSC är nödvändig för stimulus-stimulus lärande genom tysta RSC under en enda fas av ett 3-fas sensorisk prekonditionering paradigm 11,12. I korthet, råttor får infusioner av en AAV som innehåller designern receptorn och ~ 3 veckor senare administreras formgivaren läkemedlet (CNO) 30 min före starten av beteendetestning. I det nuvarande protokollet, försöksråttor får CNO under den första fasen av testning (när stimulus-stimulus learning sker) och de får fordonet under de närmaste 2 faser av att testa. För att kontrollera för oavsiktliga effekter av CNO på beteende, ingjuta råttor med designern receptorn (hM4Di) och injicera med fordon i stället för CNO. Att redogöra för generella effekter av virus infusion och receptoruttryck, ingjuta en kontrollvirus som inte innehåller designern receptorn och administrera CNO.
Ett antal olika serotyper av AAV används för att leverera genetiskt material. De nuvarande NIH riktlinjer för forskning som avser rekombinanta eller syntetiska molekyler bibehåller att AAV (alla serotyper) och rekombinanta eller syntetiska AAV-konstruktioner, i vilka transgenen inte kodar för antingen ett potentiellt tumorigen genprodukt eller en toxinmolekyl och produceras i frånvaro av en hjälparvirus kräver BSL-1 försiktighetsåtgärder (Bilaga B-1. Risk Group 1 (RG1) Agenter) 13. Ett antal betyg rör AAV struktur, nytta och säkerhet finns 14,15. Notably, fast, På grund av oro rörande eventuella reproduktions 16,17 och potentiella cancerframkallande mekanismerna 18-20 i gnagare, vissa institutioner kräver användning av BSL-2 försiktighetsåtgärder när du arbetar med AAV. Kontrollera lämplig BSL före användning genom att samråda med tillsynskommittéer på enskilda institutioner där forskningen kommer att genomföras, Centers for Disease Control and NIH riktlinjer för forskning som utförs på rekombinanta DNA-molekyler 13 vid användning av virala vektorer för genmanipulation i USA. Personliga skyddsåtgärder, utredare utbildning, vektor inneslutning, sanering, omhändertagande av sanerade material, och efter injektion djur bostäder krav specificeras av dessa riktlinjer. Dessutom, samråda med och följa lämplig Institutional Animal Care och använda riktlinjer kommitté eller motsvarande riktlinjer institutionella tillsynskommittén för att säkerställa hantering, administration och bortskaffande av AAV säker.
Detta protokoll beskriver hur man tillämpar ett farmakogen strategi (DREADD) att undersöka hur en viss hjärna region bidrar till en fler fas komplex inlärning uppgift. Med möjligheten att tillfälligt och på distans tysta neural aktivitet i diskreta hjärnregioner över faser av lärande, denna kombination av metoder ger en plattform för att undersöka ett brett spektrum av beteenden, inklusive mer nyanserad eller maskerade former av lärande. I exemplet som beskrivs i detta protokoll, kontrollråttor och råttor…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar författarna et al. Robinson 12 för deras bidrag till manuskriptet från vilken detta protokoll delvis kommer.
Male, Long Evans Rats, 55-60 d | Hilltop Lab Animals Inc | ||
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
Clozapine-N-Oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer Drug |
Rat Cage lid (Polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hours post infusion |
Filer Paper (Replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
Table Top Vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
Medline Biohazard liners | Staples | 113444 | Biohazard Trash Bags |
United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | Amazon.com | Biohazard Trash Can | |
Isoflurane, 100 mL | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
Dual Small Animal Stereotaxic with Digital Display Readout Console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
Non-rupture Ear Bars, set of 2 (Rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
Anesthesia Mask (Rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
High speed Stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
Automated Syringe pump with Micro4 Controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
Pro-animal detachable Ceramic Blade Clipper Kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
Betadine Skin Cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
Triple Antiobiotic Ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
Puralube Vet Ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
Dino-lite Rigid TableTop Boom Stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
28 Gauge 10uL Syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
Extra Tall MDF Sound attenuating Cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22'Wx22"Hx16"D |
Extra Tall Modular Test Chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
Stainless Steel Grid Floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
House Light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
Modular Pellet Dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
Pellet Recetacle, Cup Type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
Head Entry Detector for Rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
Cage Speaker for Rat Chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
Programmable Audio Generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
Smart Ctrl 8 Input/16 output Package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
Large Table Top Cabinet and Power Supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
PCI Interface Package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
MED Intel core Computer Pkg with X Pro 19" Monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
Rabbit Monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
Anti-Rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
Superfrost Plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |