To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.
For at bevirke endovaskulære infektioner og endocarditis, bakterier skal være i stand til at klæbe til karvæggen, medens den udsættes for forskydningsspændingen af strømmende blod.
At identificere de bakterielle og vært faktorer, der bidrager til vaskulær vedhæftning af mikroorganismer, der egnede modeller, der studerer disse interaktioner under fysiologiske forskydningsbetingelser nødvendig. Her beskriver vi en in vitro strømningskammeret model, der tillader at undersøge bakteriel adhæsion til forskellige komponenter i den ekstracellulære matrix eller til endotelceller, og en intravital mikroskopi model, der blev udviklet til at direkte visualisere den indledende adhæsion af bakterier til den splanknisk cirkulation in vivo . Disse metoder kan anvendes til at identificere de bakterielle og vært faktorer er nødvendige for adhæsion af bakterier under flow. Vi illustrerer relevansen af forskydningsspænding og den rolle, von Willebrand faktor for adhæsionen af Staphylococcus aureus under anvendelse af både in vitro og in vivo-model.
To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1.
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood.
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest.
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4.
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.
Shear stress er en afgørende faktor for den tidlige bakteriel adhæsion til karvæggen og til den efterfølgende generation af endovaskulær eller endokardiale vegetations og metastatiske infektioner 4,5. Vi beskrev komplementære in vitro og in vivo modeller til at studere patogenesen af endovaskulære infektioner under fysiologiske forskydningsspænding. Disse modeller har tilladt os at identificere von Willebrand-faktor-bindende protein (vWbp) som den største S. aureus-protein til at interagere under strømning med en skadet karvæggen udsætter VWF 4.
Endovaskulære infektioner og endocarditis i særdeleshed, er bekymrende, ikke kun på grund af sepsis-induceret svigt og død orgel, men også på grund af de lokale og fjerne ("metastatiske") komplikationer. At forårsage endocarditis og metastatiske infektioner, bakterier er nødt til at holde sig til karvæggen og dermed modstå forskydningsspænding af strømmende blod. Meststudier af bakterier virulensfaktorer er blevet udført i statiske forhold. Dog kan disse etablerede interaktioner ikke modstå forskydningskræfter og undersøgelser under strømningsforhold kan afsløre nye, hidtil ikke erkendte faktorer i bakterie-vært samspil.
Med micro-parallel flow kammer, har vi og andre vist betydningen af VWF for vaskulær vedhæftning. Under forskydningsspænding, VWF gradvist folder sig ud fra dens hvilested kugleformet struktur, og udsætter A1 domæne der interagerer med blodplader via sin GPIb receptor 6. Strømningskamre har været flittigt brugt til at studere trombocytfunktionen 7.
Bemærkelsesværdigt, også S. aureus adhæsion under strømning kræver VWF, særlig A1-domæne, som er blotlagt ved forskydning. Vi identificerede vWbp at mægle VWF binding. vWbp er en koagulase der bidrager til S. aureus patofysiologi ved at aktivere værtens prothrombin. Staphylothrombin, RESulting kompleks af en bakteriel koagulase og prothrombin, omdanner fibrinogen til uopløseligt fibrin 8,9. Vores undersøgelser har vist, at vWbp ikke kun aktiverer prothrombin, men udløser dannelsen af bakterier-fibrin-blodplade aggregater, som forøger adhæsion til blodkar under flow 4,10,11.
In vitro flow kammer model giver mulighed for at studere de forskellige aktører i bakteriel adhæsion til cellulære eller matrixkomponenter. Bakterielle virulensfaktorer kan studeres ved at anvende mutanter eller uskadelige bakterier udtrykker specifikke overfladeproteiner. Alternativt kan der tilsættes farmakologiske inhibitorer eller blokerende antistoffer til mediet i strømningskammeret. Den rolle, som værten faktorer som forskellige bestanddele af ekstracellulær matrix kan studeres ved at anvende dækglas med forskellige belægninger. Dækglassene kan også dækkes med endothelceller, hvoraf status aktivering kan moduleres ved at tilføje specifikke stimulatorer. Apart fra karvæggen, kan bidraget fra værten blodlegemer og plasmaproteiner blive undersøgt ved at tilsætte disse faktorer for at det strømmende medium. Således kan forskellige betingelser med stigende kompleksitet undersøges under standardiserede betingelser for laminar strømning at trævle de interaktioner, der tillader bakterier til at klæbe til karvæggen in vivo.
Interaktioner identificeret i in vitro-model efterfølgende undersøgt i en dyremodel for at teste deres relevans i en kompleks organisme. Andre in vivo modeller til at studere dynamiske interaktion under flow er blevet beskrevet, såsom hamster dorsale skinfold kammer 12 og cremaster model 13. Til sammenligning mesenteriske perfusion model her beskrevne giver flere fordele på grund af dets brugervenlighed, muligheden for at variere vært genetiske baggrund af musene og evaluere farmakologiske interventioner.
Som konklusion beskrevne modellergiver mulighed for at studere overfladeproteiner ikke kun af S. aureus, men mange andre mikroorganismer i forskellige vært baggrunde, for bedre at forstå patogenesen af vaskulære infektioner.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; "Eddy Merckx Research Grant" og "Sporta forskning Grant" for Pediatric Cardiology, UZ Leuven, Belgien (JC); Center for Molekylær og Vascular Biology er støttet af Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), med "Geconcentreerde Onderzoeksacties" (GOA 2009/13) fra University of Leuven og en forskningsbevilling fra Boehringer-Ingelheim.
Brain Heart Infusion (BHI) | BD Plastipak | 237500 | |
Tryptic Soy Broth (TSB) | Oxoid | CM0129 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-169 | D-PBS |
5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21878-25MG-F | fluorescent labeling |
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roch | 10 735 086 001 | |
Haemate-P | CSL Behring | PL 15036/0010 | VWF |
Horm collagen | Takeda | 10500 | collagen |
1-well PCA cell culture chambers | Sarstedt | ######## | plastic slips |
Temgesic | Reckitt Benckiser | 283716 | bruprenorphine |
Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum)) | Eurovet | BE-V136516 | ketamin |
XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine)) | VMD Arendonk | BE-V170581 | xylazine |
2 french intravenous catheter green | Portex | 200/300/010 | |
0,9% Sodium chloride (NaCl) | Baxter Healthcare | W7124 | |
cotton swabs | International Medical Product | 300230 | |
Ca2+-ionophore solution A23187 | Sigma-Aldrich | C7522-10 MG | |
26 gauge 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
26 gauge 1 ml syringe with needle | BD Plastipak | 300015 | intra-peritoneal injection |
Centrifuge 5810-R | Eppendorf | 5811 000.320 | |
Glass cover slips (24×50) | VWR | BB02405A11 | Thickness No, 1 |
PHD 2000 Infusion | Harvard Apparatus | 702100 | High-accuracy Harvard infusion pump |
Axio-observer DI | Carl-Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
ImageJ | National Institute of Health | Analysis software | |
Graphpad Prism 5,0 | Graphpad Software | Analysis software | |
AxioCam MRm | Carl-Zeiss | Black and white camera |