To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.
För att orsaka endovaskulära infektioner och infektiös endokardit, bakterier måste kunna ansluta sig till kärlväggen medan den utsätts för skjuvspänning av strömmande blod.
För att identifiera de bakteriella och värdfaktorer som bidrar till vaskulär vidhäftning av mikroorganismer, behövs lämpliga modeller som studerar dessa interaktioner under fysiologiska skjuvningsförhållanden. Här beskriver vi ett in vitro-flödeskammare modell som gör det möjligt att undersöka bakteriell vidhäftning till olika delar av den extracellulära matrisen eller till endotelceller, och en intravital mikroskopi modell som har utvecklats för att direkt visualisera den initiala vidhäftningen av bakterier till splanchnicus cirkulationen in vivo . Dessa metoder kan användas för att identifiera de bakteriella och värdfaktorer som krävs för vidhäftning av bakterier under flöde. Vi illustrerar betydelsen av skjuvspänningen och rollen av von Willebrand-faktor för adhesionen av Staphylococcus aureus med användning av både in vitro och in vivo-modell.
To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1.
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood.
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest.
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4.
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.
Skjuvspänning är en avgörande faktor för den tidiga bakteriell vidhäftning till kärlväggen och för nästa generation av endovaskulära eller endokardiska vegetation och metastaserande infektioner 4,5. Vi beskrev komplementära in vitro och in vivo-modeller för att studera patogenesen för endovaskulära infektioner under fysiologisk skjuvspänning. Dessa modeller har tillåtit oss att identifiera von Willebrands faktor bindande protein (vWbp) som den huvudsakliga S. aureus protein för att interagera i flödet med en skadad kärlväggen utsätta VWF 4.
Endovaskulära infektioner och infektiös endokardit i synnerhet, är av intresse inte bara på grund av sepsisinducerad organsvikt och död, men också på grund av lokala och avlägsna ("metastaserande") komplikationer. För att få infektiös endokardit och metastaserande infektioner, bakterier måste hålla sig till kärlväggen och därmed motstå skjuvspänning av strömmande blod. Meststudier av bakterier virulensfaktörer har utförts under statiska förhållanden. Dock kan dessa etablerade interaktioner inte motstå skjuvkrafter och studier inom ramen för flödesförhållanden kan avslöja nya, tidigare okända faktorer i bakterievärd samspel.
Använda mikro parallella flödeskammare, har vi och andra visat på betydelsen av VWF för vaskulär vidhäftning. Under skjuvspänning, VWF successivt Utfällbar från sitt viloläge klotformiga struktur, och exponerar A1 domän som interagerar med blodplättar via sin GPIb receptor 6. Flödeskammare har i stor utsträckning använts för att studera trombocytfunktionen 7.
Anmärkningsvärt, även S. aureus vidhäftning under flöde kräver VWF, särskilt A1-domänen som exponeras vid skjuvning. Vi identifierade vWbp att medla VWF-bindning. vWbp är en koagulas som bidrar till S. aureus patofysiologi genom att aktivera värdens protrombin. Staphylothrombin, resulting komplex av en bakteriell koagulas och protrombin, omvandlar fibrinogen till olösligt fibrin 8,9. Våra studier har visat att vWbp inte bara aktiverar protrombin, men utlöser bildningen av bakterier-fibrin-blodplättsaggregat, som ökar vidhäftningen till blodkärlen enligt flödes 4,10,11.
In vitro flödeskammare modell gör det möjligt att studera de olika aktörerna i bakteriell vidhäftning till cellulära eller matriskomponenter. Bakterie virulensfaktorer kan studeras med hjälp av mutanter eller ofarliga bakterier som uttrycker specifika ytproteiner. Alternativt kan farmakologiska hämmare eller blockerande antikroppar sättas till mediet i flödeskammaren. Kan studeras rollen av värdfaktorer såsom olika beståndsdelar i extracellulär matrix genom att använda täckglas med olika beläggningar. De täck kan också täckas med endotelceller, som aktiveringsstatus kan moduleras genom att lägga till specifika stimulatorer. Apart från kärlväggen, kan studeras bidrag av värdblodkroppar och plasmaproteiner genom att lägga till dessa faktorer till det strömmande mediet. Sålunda kan studeras olika villkor för ökande komplexitet under standardiserade villkor för laminärt flöde att avslöja växelverkningar som gör bakterier att vidhäfta till kärlväggen in vivo.
Interaktioner som identifieras i in vitro-modell därefter studeras i en djurmodell för att testa deras relevans i en komplex organism. Andra in vivo-modeller för att studera dynamiska interaktion under flöde har beskrivits, såsom hamster dorsala skinfold kammaren 12 och cremaster modellen 13. I jämförelse, den mesenteriala perfusion modell som beskrivs här erbjuder flera fördelar på grund av dess användarvänlighet, möjligheten att variera värd genetisk bakgrund av mössen och utvärdera farmakologiska interventioner.
Sammanfattningsvis, den beskrivna modellererbjuder möjligheten att studera ytproteiner inte bara av S. aureus, men av många andra mikroorganismer i olika värd bakgrunder, för att bättre förstå patogenesen av vaskulära infektioner.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; "Eddy Merckx bidrag" och "Sporta forskningsanslag" för barnkardiologisk, UZ Leuven, Belgien (JC); Centrum för molekylär och Vascular biologi stöds av Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), av "Geconcentreerde Onderzoeksacties" (GOA 2009/13) från universitetet i Leuven och ett forskningsbidrag från Boehringer-Ingelheim.
Brain Heart Infusion (BHI) | BD Plastipak | 237500 | |
Tryptic Soy Broth (TSB) | Oxoid | CM0129 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-169 | D-PBS |
5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21878-25MG-F | fluorescent labeling |
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roch | 10 735 086 001 | |
Haemate-P | CSL Behring | PL 15036/0010 | VWF |
Horm collagen | Takeda | 10500 | collagen |
1-well PCA cell culture chambers | Sarstedt | ######## | plastic slips |
Temgesic | Reckitt Benckiser | 283716 | bruprenorphine |
Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum)) | Eurovet | BE-V136516 | ketamin |
XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine)) | VMD Arendonk | BE-V170581 | xylazine |
2 french intravenous catheter green | Portex | 200/300/010 | |
0,9% Sodium chloride (NaCl) | Baxter Healthcare | W7124 | |
cotton swabs | International Medical Product | 300230 | |
Ca2+-ionophore solution A23187 | Sigma-Aldrich | C7522-10 MG | |
26 gauge 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
26 gauge 1 ml syringe with needle | BD Plastipak | 300015 | intra-peritoneal injection |
Centrifuge 5810-R | Eppendorf | 5811 000.320 | |
Glass cover slips (24×50) | VWR | BB02405A11 | Thickness No, 1 |
PHD 2000 Infusion | Harvard Apparatus | 702100 | High-accuracy Harvard infusion pump |
Axio-observer DI | Carl-Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
ImageJ | National Institute of Health | Analysis software | |
Graphpad Prism 5,0 | Graphpad Software | Analysis software | |
AxioCam MRm | Carl-Zeiss | Black and white camera |