We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.
Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.
Atomkraftsmikroskopi (AFM) alstrar en bild av en yta genom att skanna över ett område av provet under användning av en fribärande med en mycket vass spets 1. Förflyttningen av fribärande sonder ytan topologi av provet. AFM har i stor utsträckning till biologiska molekyler – inklusive proteiner, DNA och membran, på grund av sin mångsidighet i att analysera fasta prover i luften eller i närheten av infödda tillstånd i flytande 2-5.
Bortsett från sin höga upplösning avbildning förmåga i nanometerområdet, fungerar AFM fribärande som en fjäder för att undersöka interaktionskrafter (vidhäftning och repulsion) och mekaniska egenskaper hos provet 5,6. Detta kallas kraft spektroskopi. I det här läget, sonden först närmar provet och utövar en kraft på den och sedan dras tillbaka tills den förlorar kontakt med provet (Figur 1A). De genererade kurvor visar kraft som en funktion av avståndet av konsolen för både appenmört och indragning. Flera egenskaper inkluderande elasticitetsmodulen för att mäta styvheten hos ett material, och adhesionskrafter kan härledas.
Stödda lipiddubbelskikt är biologiska modellmembran som ligger på toppen av en fast bärare – vanligtvis glimmer, borsilikatglas, kvartsglas, eller oxiderad kisel 7. De framställs med hjälp av olika tekniker som vesikler nedfall, Langmuir-Blodgett metod och spin-beläggning 8,9. AFM avbildning har använts för att följa bildningen av dessa uppburna dubbelskikt 10, och sond olika strukturer bildade genom membran av olika kompositioner 11-15.
Utföra kraft spektroskopi på stöd dubbelskikt resulterar i en topp i kurvan tillvägagångssättet. Denna topp indikerar den kraft som behövs för att genomtränga tvåskiktsmembran, och kallas genombrotts kraft. Dubbelskiktet tjocklek kan även mätas med hjälp av kraftkurvan 6. Den typiska genombrott kraft dubbelskiktintervall mellan 1-50 NN 6. Dessa egenskaper beror på lipid packning (vätska eller gelfas) och struktur (acylkedja längd och omättnadsgrad) och förändras av membranaktiva medel 16. Teorin bakom bristning har förklarats 17 och andra experimentella parametrar såsom fribärande mjukhet, spetsradie och ingångshastighet påverkar också genombrottskraften 15,16,18. Force-spektroskopi har använts för att analysera egenskaper hos olika lipidfaser 11,19, sammansättning beroende förändringar 12,20, liksom effekterna av andra biomolekyler, såsom peptider, på stabiliteten hos membranet 21.
Den platta orienteringen av dubbelskikt som stöds är fördelaktig för att kombinera AFM med andra metoder, såsom ytplasmonresonans 22 och fluorescensmikroskopi 11,19 för att bättre karakterisera strukturen och egenskaperna hos membranen.
Denna detaljerade video protocol syftar till att förbereda stöds lipiddubbelskikt använder blåsavsättning och analysera dem med AFM och kraft spektroskopi. Medan vesiklar av olika storlekar kan användas för att framställa dubbelskikt, fokuserar detta protokoll på små och stora unilamellära vesiklar. Biskikten stöds att fasseparera i vätske beställt (L o) och flytande oordnade (L d) faserna kännetecknas 11,15. Membranet är sammansatt av di-oleoyl-fosfatidylkolin (DOPC), sfingomyelin (SM), och kolesterol (Chol) vid 2: 2: 1-förhållande. Denna sammansättning modeller från lipidaggregat, som föreslås att bete sig som plattformar som är viktiga för protein trafficking och sortering, cellsignalering och andra cellulära processer 23,24.
SLBs sammansatta av DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) bildades på glimmer efter vesikel adsorption och bristning inducerad av kalciumklorid. Denna lipid-komposition separeras i L d och L o faser. Den Lo fasen är anrikad på sfingomyelin och kolesterol och är mindre vätska / mer viskös (Figur 1A) än Ld fasen 11. Separationen av Lq från L d fas manifesteras som cirkulära strukturer förhöjda ovanför det omgivande (Figur …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Max Planck-sällskapet, det tyska Cancer Research Center, universitetet i Tübingen, och Bundesministerium für Bildung und Forschung (bevilja nr. 0.312.040).
Vi tackar Eduard Hermann för att hjälpa oss att automatisera analysen av kraftkurvan uppgifter och Dr. Jakob Suckale för noggrann läsning av detta manuskript.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
Sphingomyelin (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
Sodium chloride (NaCl), 99.8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
Potassium chloride (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade | AppliChem GmbH | A4689 | |
HEPES, molecular biology grade | AppliChem GmbH | A3724 | |
Glass coverslip, 24×60 mm, 1mm thickness | Duran Group | 2355036 | |
Mica blocks | NSC Mica Exports Ltd. | These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set. Always handle mica with gloves or tweezers. | |
Punch and Die Set | Precision Brand Products, Inc | 40105 | |
Optical Adhesive | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. |
Laboratory Equipment Grease | Borer Chemie AG | Glisseal N | |
Liposome Extruder | Avestin | LiposoFast-Basic | As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc. |
Adhesive Tape | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch) | |
Bath Sonicator | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf |
Silicon Nitride AFM Cantilever | Bruker AFM Probes | DNP-10 | Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m. |
AFM | JPK | JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200 |