इन्फ्लुएंजा ए वायरस nucleoprotein के साथ माउस MX1 प्रोटीन की सह immunoprecipitation
Summary
This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.
Abstract
Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP–Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.
Introduction
Myxovirus प्रतिरोध (एमएक्स) प्रोटीन वायरल रोगजनकों के खिलाफ सहज प्रतिरक्षा रक्षा का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैं। ये प्रोटीन प्रकार मैं और प्रकार III इंटरफेरॉन द्वारा प्रेरित कर रहे हैं कि बड़े dynamin तरह GTPases हैं। इसी एमएक्स जीन एक या एकाधिक प्रतियों में लगभग सभी रीढ़ में मौजूद हैं और उनके जीन उत्पादों Orthomyxoviridae (जैसे।, इन्फ्लूएंजा वायरस), Rhabdoviridae (जैसे।, vesicular stomatitis वायरस), Bunyaviridae (जैसे सहित, वायरस की एक विस्तृत श्रृंखला को रोकती हैं। ला CROSSE वायरस) और (जैसे, मानव इम्यूनो वायरस -1) 1-4 Retroviridae। इन प्रोटीनों वायरस के इस तरह के एक व्यापक सरणी को पहचान कैसे कोई स्पष्ट साझा प्राथमिक अनुक्रम इन वायरस में रूपांकनों के बिना यह स्पष्ट नहीं है। संभवतः, उनके वायरल लक्ष्य के साथ एमएक्स प्रोटीन की बातचीत का विश्लेषण अन्य मेजबान सेल कारकों के साथ उच्च आदेश परिसरों को शामिल, टी आणविक तंत्र को समझने में मदद मिलेगीटोपी वायरस और उनके मेजबानों के बीच हथियारों की होड़ में विकसित किया है।
स्तनधारी एमएक्स प्रोटीन और वायरल लक्ष्यों के बीच बातचीत मानव MxA के लिए सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। मानव MxA orthomyxoviruses इन्फ्लूएंजा ए और Thogoto वायरस सहित कई वायरस, की प्रतिकृति को बाधित कर सकते हैं। MxA जिससे संक्रमण 5 के ब्लॉक में जो परिणाम अपने परमाणु प्रविष्टि, रोकने, Thogoto वायरस Ribonucleoprotein परिसरों (vRNPs) बांधता है। MxA और Thogoto वायरस vRNPs के बीच यह बातचीत सह अवसादन और सह immunoprecipitation प्रयोगों 6-9 के साथ प्रदर्शन किया गया है। एमएक्स प्रोटीन इन्फ्लूएंजा वायरस बाधा कैसे कम स्पष्ट है। एक बड़ी समस्या यह एक एमएक्स प्रोटीन और एक इन्फ्लूएंजा जीन उत्पाद के बीच एक संवाद प्रदर्शित करने के लिए सरल नहीं है। एक रिपोर्ट इन्फ्लूएंजा में एक वायरस से संक्रमित कोशिकाओं को 10 मानव MxA और एनपी प्रोटीन के बीच एक संवाद का प्रदर्शन किया। यह बातचीत केवल सह immunopr द्वारा दिखाया जा सकता हैecipitation कोशिकाओं बातचीत क्षणिक और / या कमजोर है, सुझाव है कि सेल से पहले पार से जोड़ने अभिकर्मक dithiobis (succinimidyl प्रोपियोनेट) के साथ इलाज किया गया था। अधिक हाल के अध्ययनों से अलग इन्फ्लूएंजा ए उपभेदों के अंतर एमएक्स संवेदनशीलता एनपी प्रोटीन 11,12 की उत्पत्ति से निर्धारित होता है कि पता चला है। इस के साथ लाइन में, इन्फ्लूएंजा वायरस आंशिक रूप से एनपी प्रोटीन 13 में विशिष्ट अवशेषों परिवर्तनशील द्वारा एमएक्स नियंत्रण से बच सकते हैं। यह मेजबान एमएक्स के लिए इन्फ्लूएंजा वायरस का मुख्य लक्ष्य सबसे शायद एनपी vRNP परिसरों में इकट्ठे एनपी प्रोटीन, है कि पता चलता है। हालांकि, इन अधिक हाल के अध्ययनों से कोई भी इन्फ्लूएंजा एनपी या vRNPs और या तो मानव MxA या माउस MX1 के बीच एक संवाद का प्रदर्शन किया।
हाल ही में हमने पहली बार के लिए, पता चला है, विस्तार से यहाँ वर्णन किया गया है जो एक अनुकूलित सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल 14, साथ इन्फ्लूएंजा एनपी और माउस MX1 प्रोटीन के बीच एक संवाद। जनरल, सह-मैं मेंmmunoprecipitation प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की जांच के लिए सबसे अक्सर इस्तेमाल जैव रासायनिक तरीकों में से एक है। यह उनके प्राकृतिक वातावरण में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की जांच करने की अनुमति देता है के बाद से इस तकनीक को अक्सर, वैकल्पिक तकनीकों, जैसे, खमीर दो संकर अधिक पसंद है। ब्याज की प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी उपलब्ध हैं अगर सह immunoprecipitation endogenously व्यक्त प्रोटीन पर बाहर किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, ब्याज की प्रोटीन अभिकर्मक या संक्रमण के माध्यम से सेल में व्यक्त किया जा सकता है और एक समानता टैग इस्तेमाल किया जा सकता है। उपर्युक्त फायदे के अलावा, वर्णित सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल कमजोर और / या क्षणिक प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। इस अनुकूलित प्रोटोकॉल में मुख्य घटक सेल बफर में एन ethylmaleimide (NEM) के अतिरिक्त है। NEM 6.5-7.5 के पीएच पर, इस तरह के cysteines में उपहार के रूप में मुक्त thiol समूहों के साथ प्रतिक्रिया करता है कि एक क्षारीकरण अभिकर्मक है, एक स्थिर Thio-एस्टर के लिए फार्म(चित्र 1)। उच्च पीएच कम, NEM भी एमिनो समूहों के साथ प्रतिक्रिया या हाइड्रोलिसिस 15 से गुजरना कर सकते हैं। NEM आम तौर पर डाइसल्फ़ाइड बांड गठन को रोकने या enzymatic गतिविधि को बाधित करने के लिए, मुक्त thiol समूहों को ब्लॉक करने के लिए प्रयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, NEM अक्सर सिस्टीन प्रोटिएजों हैं जो desumoylating एंजाइमों, ब्लॉक करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह इन्फ्लूएंजा प्रोटीन की sumoylation वायरल प्रोटीन 16 के बीच बातचीत प्रभावित कर सकते हैं कि सूचित किया गया था, क्योंकि वर्णित सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल में, NEM शुरू में lysis बफर में शामिल किया गया था। अप्रत्याशित रूप से, NEM के अलावा सह immunoprecipitation द्वारा इन्फ्लूएंजा एनपी और माउस MX1 के बीच बातचीत करने के लिए दस्तावेज़ कुंजी साबित हुई। NEM के अलावा एनपी MX1 बातचीत का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है क्यों यह स्पष्ट नहीं है। संभवत: बातचीत भी क्षणिक और / या कमजोर है। NEM MX1 की एक विशिष्ट रचना, एक वायरल प्रोटीन या यहां तक कि एक अज्ञात तीसरे कम्पो संरक्षण के द्वारा, जैसे संपर्क, स्थिर कर सकतामाने। NEM के इस तरह के एक स्थिर प्रभाव ribonucleotide रिडक्टेस एम 1 और उसके अवरोध करनेवाला gemcitabine (F2dC) 17 के बीच बातचीत के लिए, उदाहरण के लिए, पहले देखा गया है। MX1 और एनपी दोनों NEM द्वारा संशोधित किया जा सकता है, जो कई सिस्टीन अवशेष होते हैं। उदाहरण के लिए, रेनी एट अल। द्वारा हाल के एक अध्ययन एक stalkless MxA-संस्करण iodoacetamide द्वारा संशोधित किया जा सकता है, जो तीन विलायक उजागर सिस्टीन अवशेषों में शामिल है कि प्रदर्शन किया। Serines करने के लिए इन अवशेषों परिवर्तनशील MxA के enzymatic गतिविधि को प्रभावित है, लेकिन डाइसल्फ़ाइड की मध्यस्थता एकत्रीकरण 18 रोका नहीं था। इन cysteines MX1 में संरक्षित कर रहे हैं, इस MX1 में अनुरूप cysteines NEM से और इस तरह के प्रभाव अपनी रचना या विलेयता के रूप में संशोधित किया जा सकता है कि पता चलता है। इसके अलावा, NEM भी MX1 के विरोधी इन्फ्लूएंजा गतिविधि के लिए आवश्यक है जो MX1 के GTPase गतिविधि को प्रभावित है, और इस तरह MX1 और एनपी के बीच बातचीत को स्थिर कर सकते हैं। हालांकि, GTPase acti पर NEM का एक सीधा प्रभावNEM भी इन्फ्लूएंजा एनपी और GTPase MX1 प्रोटीन 14 के निष्क्रिय म्यूटेंट के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए आवश्यक है के रूप में MX1 की vity, संभावना नहीं है। जाहिर है, और अधिक शोध एनपी MX1 बातचीत पर NEM के प्रभाव को जानने की जरूरत है।
सारांश में, वर्णित सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल एंटीवायरल MX1 प्रोटीन और उसके वायरल लक्ष्य, इन्फ्लूएंजा एनपी प्रोटीन के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल भी विशिष्ट प्रोटीन रचना का स्थिरीकरण पर निर्भर करती है कि अन्य कमजोर या क्षणिक बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विशिष्ट रचना पर निर्भर करती है कि प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत ऐसे Calmodulin 19 के रूप में कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन के लिए, उदाहरण के लिए, पहले वर्णित किया गया है। अंत में, NEM का लाभकारी भूमिका भी इस तरह के सह अवसादन assays के रूप में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने कि अन्य तरीकों में इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एंटीवायरल प्रोटीन और उनके वायरल लक्ष्यों के बीच बातचीत का अध्ययन कर इन प्रोटीनों की एंटीवायरल तंत्र के विवरण को समझने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। इस नए एंटीवायरल रणनीतियों के विकास के लिए आधार वायरस औ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम FWO-Vlaanderen, IOF परियोजना IOF10 / StarTT / 027 और गेन्ट विश्वविद्यालय के विशेष अनुसंधान अनुदान BOF12 / गोवा / 014 द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| DMEM high glucose | Gibco | 52100-047 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E-3876 | Toxic |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | also known as NP40 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11 873 580 001 | |
| anti-NP monoclonal antibody | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-4282 | ascites blend of clones A1 and A3 |
| anti-RNP polyclonal serum | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-3133 | directed against A/Scotland/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 cm | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Pierce | 32106 |
Riferimenti
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