Synthetic protein sequences based on consensus motifs typically ignore co-evolving residues, that imply interpositional dependencies (IPDs). IPDs can be essential to activity, and designs that disregard them may result in suboptimal results. This protocol uses StickWRLD to identify IPDs and help inform rational protein design, resulting in more efficient results.
प्रोटीन संरेखण सामान्यतः प्रोटीन अवशेषों की समानता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है, और व्युत्पन्न आम सहमति अनुक्रम कार्यात्मक इकाइयों (उदाहरण के लिए, डोमेन) की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया। विकास भर में और phylogentic पेड़ भर में एक साथ प्रदर्शित करने के लिए करते हैं कि अवशेषों के कार्यात्मक आवश्यक covariation – पारंपरिक आम सहमति निर्माण मॉडल interpositional निर्भरता के लिए खाते में असफल। इन रिश्तों को प्रोटीन तह, thermostability, और बदले में कृत्रिम प्रोटीन के इंजीनियरिंग सूचित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो कार्यात्मक साइटों, के गठन की प्रक्रिया के बारे में महत्वपूर्ण सुराग प्रकट कर सकते हैं। दुर्भाग्य से, इन रिश्तों को अनिवार्य रूप से सरल "बहुमत नियम" या यहां तक कि हम्म आधारित आम सहमति मॉडल ने भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है, जो उप-रूपांकनों रूप है, और परिणाम प्रकृति में ही कभी नहीं देखा नहीं है, लेकिन कम से व्यवहार्य है, जो एक जैविक रूप से अमान्य "आम सहमति" हो सकता है किसी भी मौजूदा प्रोटीन की तुलना में। हम एक दृश्य एक विकसित किया हैस्पष्ट रूप से एक प्रोटीन संरेखण के एक इंटरैक्टिव 3 डी प्रतिनिधित्व बनाता है और जो alytics उपकरण, StickWRLD, अवशेषों covarying प्रदर्शित करता है। उपयोगकर्ता पैन और ज़ूम, साथ ही गतिशील रूप के रूप में covariants की पहचान अंतर्निहित सांख्यिकीय दहलीज बदलने की क्षमता है। StickWRLD पहले से सफलतापूर्वक ऐसी Adenylate Kinase के रूप में और इस तरह के endonuclease लक्ष्य साइटों के रूप में डीएनए दृश्यों में प्रोटीन में कार्यात्मक रूप से आवश्यक covarying अवशेषों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
प्रोटीन संरेखण लंबे समय से एक प्रोटीन परिवार में अवशेषों की समानता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। एक प्रोटीन (जैसे, उत्प्रेरक या अन्य बाध्यकारी साइटों) की अकसर सबसे दिलचस्प सुविधाओं संपर्क में रेखीय क्रम के बाहर के क्षेत्रों को लाने तह प्रोटीन का परिणाम है, और एक परिणाम के रूप में संरेखण में इन जाहिरा तौर पर असंबंधित क्षेत्रों को विकसित और में बदल देते हैं एक समन्वित फैशन। अन्य मामलों में, एक प्रोटीन के समारोह में अपने इलेक्ट्रोस्टैटिक हस्ताक्षर पर निर्भर हो सकता है, और इलेक्ट्रॉनिक द्विध्रुवीय को प्रभावित करने वाले म्यूटेशन दूर आरोप लगाया अवशेषों में परिवर्तन के लिए मुआवजा रहे हैं। Allosteric प्रभाव भी अवशेषों पहचानों के बीच लंबी दूरी अनुक्रमिक और स्थानिक निर्भरता को प्रेरित कर सकते हैं। भले ही उनकी मूल के अवशेषों के इन कार्यात्मक-आवश्यक covariations – इंटर-स्थितीय निर्भरता (IPDS) – संरेखण (चित्रा 1) के दृश्य परीक्षा के साथ स्पष्ट नहीं हो सकता। IPDs की पहचान – के रूप में अच्छी तरह के रूप मेंउन पदों के भीतर विशिष्ट अवशेष एक इकाई के रूप में covary के लिए करते हैं – जो प्रोटीन तह की प्रक्रियाओं और कार्यात्मक साइटों के गठन के बारे में महत्वपूर्ण सुराग प्रकट कर सकते हैं। यह जानकारी तो thermostability और गतिविधि के मामले में सिंथेटिक (इंजीनियर) प्रोटीन का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह लंबे समय से आम सहमति की ओर सभी बिंदु उत्परिवर्तन स्थिरता में सुधार या गतिविधि प्रदान नहीं कि ज्ञात किया गया है। हाल ही में, प्रोटीन बिंदु उत्परिवर्तन 3 स्थिर रखने के विचार के समान (तैयारी में पांडुलिपि) सख्ती से आम सहमति 1,2 से बनाया गया एक ही प्रोटीन, की तुलना में अधिक से अधिक गतिविधि में परिणाम दिखाया गया है उनके अनुक्रम में जाना जाता IPDs का लाभ लेने के लिए बनाया गया है।
दुर्भाग्य से, परंपरागत सर्वसम्मति निर्माण मॉडल (जैसे, बहुमत शासन) केवल दुर्घटना से IPDs कब्जा। आम सहमति और स्थिति विशिष्ट स्कोरिंग मैट्रिक्स विधियों IPDs से अनभिज्ञ हैं और केवल 'सही ढंग से' मॉडल, जब निर्भर अवशेषों में उन्हें शामिलपरिवार में उन पदों के लिए सबसे लोकप्रिय अवशेष भी हैं। मार्कोव श्रृंखला मॉडल वे क्रमिक रूप से समीपस्थ हैं, लेकिन उनके विशिष्ट कार्यान्वयन तत्काल अनुक्रमिक पड़ोसियों के अलावा सब कुछ ध्यान नहीं देता है, और यहां तक कि उनके सबसे अच्छे रूप में, छुपे हुए मार्कोव मॉडल गणना (देखें चित्र 2) जब IPDs कब्जा निर्भरताओं से अधिक के अनुसार इस क्रम में अलग हो रहे हैं जब असभ्य बन सकता है एक दर्जन या तो 4 पदों। इन IPDs अनिवार्य रूप से सरल "बहुमत नियम" या यहां तक कि हम्म आधारित आम सहमति मॉडल ने भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है, जो "उप रूपांकनों" फार्म के बाद से 5,6 परिणाम प्रकृति में ही कभी नहीं देखा नहीं है, लेकिन जो एक जैविक रूप से अमान्य "आम सहमति" हो सकता है कम किसी भी मौजूदा प्रोटीन से व्यवहार्य। ऐसे Gremlin के रूप में 7 मार्कोव रैंडम फील्ड्स, पर आधारित सिस्टम, इन समस्याओं को दूर करने का प्रयास। ऐसे noncontiguous पुनर्संयोजन 3,8 के रूप में परिष्कृत जैव रासायनिक / जैविक तकनीक आईडीई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इसके अतिरिक्त, जबकिक्षेत्र द्वारा ntify आवश्यक प्रोटीन तत्वों, वे एकल आधार जोड़ी परिशुद्धता प्राप्त किया जा करने के लिए काफी समय और बेंच काम की आवश्यकता होती है।
StickWRLD 9 IPDs स्पष्ट है और आसानी से समझ में आता है कि एक प्रोटीन संरेखण के एक इंटरैक्टिव 3 डी प्रतिनिधित्व बनाता है एक अजगर आधारित कार्यक्रम है। संरेखण में प्रत्येक स्थिति प्रत्येक स्तंभ क्षेत्रों की हो चुकी है, संरेखण के भीतर उस स्थिति में मौजूद हो सकता है कि 20 अमीनो एसिड से प्रत्येक के लिए एक के शामिल है, जहां प्रदर्शन में एक स्तंभ के रूप में प्रतिनिधित्व किया है। क्षेत्र आकार उपयोगकर्ता तुरंत आम सहमति छाछ या बस क्षेत्रों के आकार को देखकर लगता है कि स्थिति के भीतर अमीनो एसिड के सापेक्ष वितरण बटोरने कर सकते हैं कि इस तरह के अमीनो एसिड की घटना की आवृत्ति पर निर्भर है। प्रत्येक स्थिति का प्रतिनिधित्व कॉलम एक सिलेंडर के चारों ओर लिपटा कर रहे हैं। यह एक स्पष्ट 'दृष्टि की लाइन' संरेखण में प्रत्येक स्थान पर एक संभव अमीनो एसिड का प्रतिनिधित्व हर क्षेत्र देता हैहर दूसरे स्थान पर हर दूसरे अमीनो एसिड संभावना के लिए। दृश्य करने से पहले, StickWRLD IPDs 9 की पहचान करने के अवशेषों के सभी संभव संयोजनों के बीच संबंध ताकत खरीदते हैं। IPDs का प्रतिनिधित्व करने के लिए, लाइनों पर coevolving कर रहे हैं जो अवशेषों के बीच तैयार कर रहे हैं पदों में मौजूद अवशेषों (IPDS) स्वतंत्र थे उम्मीद होगी की तुलना में अधिक है, या कम है।
इतना ही नहीं अनुक्रम पदों evolutionarily बातचीत जो इस दृश्य दिखाती है, लेकिन आईपीडी किनारे लाइनों प्रत्येक स्तंभ में अमीनो एसिड के बीच के क्षेत्रों तैयार कर रहे हैं, के रूप में उपयोगकर्ता जल्दी विशिष्ट एमिनो एसिड प्रत्येक स्थिति में coevolving हो जाते हैं, जो निर्धारित कर सकते हैं। उपयोगकर्ता बारी बारी से और कल्पना की आईपीडी संरचना का पता लगाने, के रूप में अच्छी तरह से गतिशील रूप के रूप में StickWRLD IPDs के लिए एक शक्तिशाली खोज उपकरण बनाने सह-संबंध के प्रदर्शन को नियंत्रित करने, सांख्यिकीय थ्रेसहोल्ड बदलने की क्षमता है।
ऐसे gremlin 7 simil के रूप में आवेदनआर्ली अवशेषों के बीच जटिल रिलेशनल जानकारी प्रदर्शित – लेकिन इन रिश्तों को किसी भी सशर्त रिश्तों को निर्धारित करने के लिए तैयार नहीं हैं, जो अधिक परंपरागत मार्कोव मॉडल, के माध्यम से गणना कर रहे हैं। जैसे, इन 2D अनुमानों के रूप में प्रदर्शित किया जा रहा करने में सक्षम हैं। इसके विपरीत, StickWRLD गणना और 2 डी ग्राफ (धार रोड़ा के रूप में जाना जाता घटना) के रूप में प्रदान अगर अस्पष्ट किया जा सकता है जो बहु-नोड सशर्त निर्भरता, प्रदर्शित कर सकते हैं।
StickWRLD '3 डी दृश्य भी कई अन्य लाभ हैं। घूर्णन, panning, और zooming – – और अधिक आसानी से StickWRLD के 3 डी सिलेंडर में देखा जा सकता है अस्पष्ट या एक 2 डी प्रतिनिधित्व में unintuitive जा सकता है कि सुविधाओं के उपयोगकर्ताओं दृश्य में हेरफेर करने की अनुमति देकर। StickWRLD अनिवार्य रूप से पैटर्न और रुझान देखने के लिए मानव मस्तिष्क के पैटर्न मान्यता क्षमता की शक्ति का दोहन एक दृश्य विश्लेषिकी उपकरण, और विभिन्न दृष्टिकोणों से डेटा का पता लगाने के लिए की क्षमता ही यह करने के लिए उधार देता है।
StickWRLD सफलतापूर्वक रो-निर्भर Terminators 9 में Adenylate Kinase ढक्कन डोमेन 16 में इस तरह के IPDs, साथ ही जुड़े डीएनए ठिकानों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया, और अर्चेअल टीआरएनए Intron endonuclease 6 लक्ष्य साइटों में एक उपन्यास ब्याह-साइट विशिष्टता किया गया है। ये IPDs संरेखण का एक सीधा परीक्षा के माध्यम से पता लगाने योग्य नहीं थे।
StickWRLD प्रत्येक क्षेत्र में 20 अमीनो एसिड के अवशेष और क्षेत्र के आकार का प्रतिनिधित्व करता है, जहां 20 "क्षेत्रों", के एक स्तंभ के रूप में एक संरेखण में से प्रत्येक स्थिति को प्रदर्शित करता है कि स्तंभ के भीतर है कि विशेष रूप अवशेषों की घटना की आवृत्ति (चित्रा 4) इंगित करता है। कॉलम (एक आईपीडी का संकेत है) किनारे लाइनों विभिन्न स्तंभों में अवशेषों को जोड़ने के साथ, एक सिलेंडर में व्यवस्थित कर रहे हैं। थ्रेसहोल्ड – इसी अवशेषों पी मूल्य (महत्व) और अवशिष्ट (मनाया होने की उम्मीद है) दोनों श्रेष्ठ एक आवृत्ति पर covarying रहे हैं, तो ये बढ़त लाइनें ही तैयार कर रहे हैं।
एक डीएनए या प्रोटीन अनुक्रम संरेखण के बाहर के क्षेत्रों में सहयोग से होने वाली अन्योन्याश्रित अवशेष, या IPDs, की जांच के मानक अनुक्रम संरेखण उपकरण 6 का उपयोग कर पाना मुश्किल है। इस तरह के उपकरणों के लिए एक आम सहमति, या आकृति, दृश्य उत्पन्न करते हैं, इस आम सहमति कई मामलों में एक साधारण बहुमत के नियम औसत है और एक या एक से अधिक उप रूपांकनों फार्म का हो सकता है कि covariation रिश्तों को व्यक्त नहीं करता है – सह विकसित करने के लिए करते हैं कि अवशेषों का समूहों। पड़ोसी निर्भरता को पता लगाने में सक्षम हैं जो यहां तक कि हम्म मॉडल, बाहर का IPDs 5 के साथ नहीं कर सकते हैं सही मॉडल अनुक्रम रूपांकनों। और, वास्तव में, इष्टतम नहीं हो सकता है इस तरह के कम्प्यूटेशनल आम सहमति पर आधारित इंजीनियर प्रोटीन – परिणाम गणना की आम सहमति वास्तव में एक प्रकृति में नहीं पाया "कृत्रिम" अनुक्रम हो सकता है। वास्तव में, ADK के लिए Pfam हम्म एच के tetracysteine आकृति का आधा है, और आधे से युक्त एक काइमेरिक प्रोटीन, एस, डी, टी आकृति, कार्यात्मक बस के रूप में स्वीकार्य है सुझाव है किकिसी भी वास्तव में मौजूदा ADK के रूप में। ऐसे काइमेरा (और इन रूपांकनों के कई अन्य blendings) catalytically 4,19 मृत हैं, क्योंकि यह मामला नहीं है।
सह-संबंध की तलाश में, यह अवशिष्ट दहलीज किसी भी किनारों देखा और फिर धीरे धीरे वापस नीचे दहलीज ramping हैं, जिस पर स्तर से ऊपर दहलीज सेटिंग से प्रासंगिक सह-संबंध की खोज के लिए अनुमति देने के लिए समायोजित किया जाना है कि महत्वपूर्ण है। यह केवल सबसे महत्वपूर्ण किनारों शुरू में माना जाता है कि यह सुनिश्चित करता है।
एक वैकल्पिक दृष्टिकोण अत्यंत कम सेट अवशिष्ट सीमा के साथ शुरू करने के लिए है। यह सभी महत्वपूर्ण किनारों के प्रदर्शन में यह परिणाम है। यहाँ से अवशिष्ट दहलीज धीरे धीरे पैटर्न में उभरने जब तक किनारों बाहर ड्रॉप करने के लिए अनुमति देता है, बढ़ाया जा सकता है। विशिष्ट नोड्स (उदाहरण के लिए, डोमेन ज्ञान के आवेदन) के शामिल किए जाने के लिए देख जब इस दृष्टिकोण कम उपयोगी है, यह एक विज़ के रूप में StickWRLD का उपयोग कर अप्रत्याशित रिश्तों की खोज के लिए अनुमति देता हैयौन विश्लेषणात्मक उपकरण के डेटा दृश्य में उभरते पैटर्न खोजने के लिए।
StickWRLD यह प्रदर्शन युक्ति के संकल्प के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चलाया जाता है, जिस पर प्रणाली की उपलब्ध स्मृति द्वारा मुख्य रूप से सीमित है। वहाँ StickWRLD जांच कर सकते हैं डेटा बिंदुओं की संख्या की कोई सैद्धांतिक सीमा है, और व्यवहार में, परीक्षण किया गया है 20,000 पदों के लिए ऊपर दृश्यों जबकि StickWRLD लगभग 1,000 पदों के लिए ऊपर दृश्यों के साथ सबसे अच्छा प्रदर्शन करती है।
StickWRLD का प्राथमिक लाभ एक दूसरे के साथ covary कि अवशेषों के समूहों की पहचान करने की क्षमता में निहित है। यह एक साधारण सांख्यिकीय औसत है और खाते में coevolution नहीं ले करता है, जो सांख्यिकीय आम सहमति अनुक्रम के परंपरागत दृष्टिकोण पर एक महत्वपूर्ण लाभ है। कुछ मामलों में covarying अवशेषों बस फिलोजेनी की एक विरूपण साक्ष्य हो सकता है, यहां तक कि इन अवशेषों "चयन की कसौटी" झेल, और इस तरह के रूप में कार्यात्मक में कोई कमी की संभावना नहीं हैकिसी भी प्रोटीन के रूप में lity उन्हें शामिल करने के लिए इंजीनियर।
त्रुटि के लिए क्षमता को कम करने और समारोह का तेजी से अनुकूलन का समर्थन करेंगे पूर्व इंजीनियरिंग सिंथेटिक वेरिएंट के लिए एक विहित डीएनए या प्रोटीन अनुक्रम आम सहमति / आकृति में IPDs की पहचान करने के लिए StickWRLD का उपयोग करते समय, यह StickWRLD एक सामान्यीकृत सहसंबंध पहचान उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए और प्रोटीन डेटा को विशेष रूप से सीमित नहीं है। नेत्रहीन किसी भी ठीक से इनकोडिंग डेटा सेट में किसी भी चर के सह घटना को खोजने के लिए StickWRLD इस्तेमाल किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
StickWRLD was made possible in part through funding provided to Dr. Ray by the Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, and by NSF grant DBI-1262457.
Mac or Ubuntu OS computer | Various | NA | Any Mac or linux (e.g. Ubuntu) computer capable of running python & associated shell scripts |
Python programming language | python.org | NA | Python version 2.7.6 or greater recommended |
wxPython library | wxpython.org | NA | Latest version recommended |
SciPy library | scipy.org | NA | Latest version recommended |
PyOpenGL library | pyopengl.sourceforge.net | NA | Latest version recommended |
StickWRLD Python scripts | NCH BCCM | NA | Available from http://www.stickwrld.org |
fasta2stick.sh file converter | NCH BCCM | NA | Available from http://www.stickwrld.org |
Protein and/or DNA sequence data | NA | NA | Samples available at http://www.stickwrld.org |