Synthetic protein sequences based on consensus motifs typically ignore co-evolving residues, that imply interpositional dependencies (IPDs). IPDs can be essential to activity, and designs that disregard them may result in suboptimal results. This protocol uses StickWRLD to identify IPDs and help inform rational protein design, resulting in more efficient results.
Proteininpass används vanligtvis för att utvärdera likhet i proteinrester, och den härledda konsensussekvensen som används för identifiering av funktionella enheter (t.ex. domäner). Traditionella samförstånd bygga modeller misslyckas med att redogöra för interpositional beroenden – funktionellt krävs samvariation av rester som tenderar att visas samtidigt i hela evolutionen och över phylogentic träd. Dessa relationer kan avslöja viktiga ledtrådar om processerna för proteinveckning, termostabilitet, och bildningen av funktionella ställen, som i sin tur kan användas för att informera konstruktion av syntetiska proteiner. Tyvärr är dessa förhållanden bildar väsentligen under motiv som inte kan förutsägas med enkel "majoritetsstyre" eller till och med HMM-baserade konsensusmodeller, och resultatet kan vara en biologiskt ogiltig "konsensus" som inte bara är aldrig sett i naturen men är mindre lönsamt än någon ännu existerande protein. Vi har utvecklat en visuell ettalytics verktyg, StickWRLD, vilket skapar en interaktiv 3D-representation av ett protein inriktning och tydligt visar covarying rester. Användaren har möjlighet att panorera och zooma, samt dynamiskt ändra den statistiska tröskeln ligger till grund för identifieringen av kovariater. StickWRLD har tidigare använts framgångsrikt för att identifiera funktionellt erforderliga covarying rester i proteiner såsom adenylatkinas och i DNA-sekvenser såsom endonukleas målställen.
Protein anpassningar har länge använts för att utvärdera likheten av rester i en proteinfamilj. Vanliga de mest intressanta egenskaperna hos ett protein (t.ex. katalytiska eller andra bindningsställen) är resultatet av proteinveckning föra distala regioner av den linjära sekvensen i kontakt, och som ett resultat är dessa till synes obesläktade regioner i anpassningen tenderar att utvecklas och förändras i ett samordnat sätt. I andra fall kan funktionen hos ett protein vara beroende av dess elektro signatur, och mutationer som påverkar den elektroniska dipolen kompenseras genom ändringar i avlägsna laddade rester. Allosterisk effekter kan också leda till långsiktiga sekventiella och rumsliga beroenden mellan rest identiteter. Oavsett deras ursprung, dessa funktionellt krävs uppmätta samband med rester – interpositions beroenden (IPDS) – får inte vara självklart med visuell undersökning av anpassningen (Figur 1). Identifiering av IPDS – liksom avvilka specifika rester inom dessa positioner tenderar att samvariera som en enhet – kan avslöja viktiga ledtrådar om processerna för proteinvikning och bildning av funktionella ställen. Denna information kan sedan användas för att optimera syntetiska (manipulerade) proteiner i form av termo och aktivitet. Det har länge varit känt att inte alla punktmutationer mot konsensus ger förbättrad stabilitet eller aktivitet. På senare tid, proteiner som syftar till att dra nytta av kända IPDS i deras sekvens har visat sig leda till högre aktivitet än samma protein utformad strikt från konsensus 1,2 (manuskript under utarbetande), liknar idén att stabilisera punktmutationer 3.
Tyvärr, traditionella konsensus bygga modeller (t.ex. majoritetsstyre) bara fånga IPDS av en slump. Konsensus och Position Specifik Scoring Matrix metoder är okunniga om IPDS och bara "rätt" inkludera dem i modeller, när de beroende resterär också de mest populära rester för dessa positioner i familjen. Markov Chain modeller kan fånga IPDS när de är i tur och ordning proximal, men deras typisk implementering ignorerar allt utom omedelbara sekventiella grannar, och även vid sitt bästa, Hidden Markov Modellberäkningar (se figur 2) blir svår när beroenden separeras i sekvensen med mer än ett tiotal positionerna 4. Eftersom dessa IPDS bildar i huvudsak "sub-motiv", som inte kan förutsägas med enkel "majoritetsstyre" eller till och med HMM-baserade konsensusmodeller 5,6 resultatet kan vara en biologiskt ogiltig "konsensus" som inte bara är aldrig sett i naturen men är mindre lönsamt än någon existerande protein. System baserade på Markov Random Fields, såsom SMÅDJÄVUL 7, försöka övervinna dessa problem. Dessutom medan sofistikerade biologiska / biokemiska tekniker såsom icke sammanhängande rekombination 3,8 kan användas till IDEntify väsentliga proteinelement per region, kräver de mycket tid och bänkarbete för enkel baspar precision uppnås.
StickWRLD 9 är en Python baserat program som skapar en interaktiv 3D-representation av ett protein inriktning som gör IPDS tydliga och lätta att förstå. Varje position i uppriktningen representeras som en kolumn i teckenfönstret, där varje kolumn består av en stapel av sfärer, en för vardera av de 20 aminosyror som kan vara närvarande i denna position inom anpassningen. Klotet storlek är beroende av frekvensen av aminosyran, så att användaren omedelbart kan få fram konsensusrest eller den relativa fördelningen av aminosyror i den positionen genom att helt enkelt titta på storleken på sfärerna. Kolonnerna representerar varje position är lindade kring en cylinder. Detta ger alla områden som representerar en möjlig aminosyra vid varje position i linje, en tydlig "siktlinje"till varje annan möjlighet aminosyra vid varje annat läge. Före visualisering, StickWRLD beräknar korrelationsstyrkan mellan alla möjliga kombinationer av rester för att identifiera IPDS 9. Att representera IPDS är linjer dragna mellan rester som coevolving på en högre eller lägre än vad som skulle förväntas om resterna närvarande i positionerna var oberoende (IPDS).
Inte bara gör detta visualisering show som sekvenspositioner samverkar evolutionärt, men eftersom IPD kantlinjer dras mellan aminosyra sfärer i varje kolumn, kan användaren snabbt avgöra vilka specifika aminosyror tenderar att coevolving vid varje position. Användaren har möjlighet att rotera och utforska den åskådlig IPD struktur, såväl som dynamiskt ändra de statistiska tröskelvärden som styr visningen av korrelationer, vilket gör StickWRLD ett kraftfullt upptäckt verktyg för IPDS.
Applikationer såsom SMÅDJÄVUL 7 similArly visa komplex relations information mellan rester – men dessa förhållanden beräknas via mer traditionella Markov-modeller, som inte är utformade för att fastställa eventuella villkorade relationer. Som sådan, det är i stånd att visas som 2D prognoser. Däremot kan StickWRLD beräkna och visa flera noder villkorade beroenden, som kan förvrängd om återges som en 2D-graf (ett fenomen som kallas kant ocklusion).
StickWRLD s 3D-vy har också flera andra fördelar. Genom att låta användare att manipulera visuella – panorera, rotera och zooma – funktioner som kan förvrängd eller intuitiv i en 2D representation lättare kan ses i 3D cylinder StickWRLD. StickWRLD är i huvudsak en visuell analysverktyg, utnyttja kraften i den mänskliga hjärnans mönsterigenkänning förmåga att se mönster och trender, och möjligheten att utforska data från olika perspektiv lämpar sig för detta.
StickWRLD har framgångsrikt använts för att identifiera sådana IPDS i adenylatkinas Lid domän 16, samt tillhörande DNA-baser i Rho beroende terminatorer 9, och en ny skarv plats specificitet i archaeal tRNA intron endonukleas 6 målplatser. Dessa IPDS var inte upptäckas via en direkt undersökning av anpassningar.
StickWRLD visar varje position av en anpassning som en kolonn av 20 "sfärer", där varje sfär representerar en av de 20 aminosyrarester och storleken av sfären anger frekvensen för förekomst av detta särskild rest inom den kolumnen (Figur 4). Kolumnerna är anordnade i en cylinder, med kantlinjer som förbinder rester i olika kolumner (vilket tyder på en IPD). Dessa kantlinjer endast dras om motsvarande rester covarying vid en frekvens överträffar både p-värdet (betydelse) och rest (förväntade – observerade) trösklar.
Upptäckt av samarbete förekommer beroende av varandra rester, eller IPDS, i distala regioner i en DNA eller proteinsekvens anpassning är svårt att använda standardsekvensjusteringsverktygen 6. Även om sådana verktyg generera en konsensus, eller motiv, sekvens, är detta samförstånd i många fall en enkel majoritet regel medelvärdes och inte förmedla samvariation relationer som kan bilda en eller flera under motiv – grupper av restsubstanser som tenderar att samarbeta utvecklas. Även HMM modeller, som är i stånd att upptäcka grann beroenden, kan inte exakt modell sekvensmotiv med distala IPDS 5. Resultatet är att den beräknade konsensus kan i själva verket vara en "syntetisk" sekvens som inte finns i naturen – och manipulerade proteiner baserade på sådan beräknings konsensus får i själva verket inte, vara optimal. I själva verket skulle Pfam HMM för ADK antyder att ett chimärt protein innehållande hälften av tetracysteine motiv, och hälften av H, S, D, T-motiv, är funktionellt lika acceptabeltsom någon faktiskt existerande ADK. Detta är inte fallet, eftersom sådana chimärer (och många andra blandning som av dessa motiv) Är katalytiskt död 4,19.
När du letar efter korrelationer, är det viktigt att den kvarvarande tröskeln justeras för att göra det möjligt för upptäckten av relevanta korrelationer genom att sätta den tröskel över den nivå där alla kanter syns och sedan gradvis ramp tröskeln tillbaka. Detta säkerställer att endast de mest signifikanta kanterna anses initialt.
Ett alternativt tillvägagångssätt är att börja med den kvarvarande tröskelvärdet satt extremt låg. Detta resulterar i visningen av alla väsentliga kanter. Härifrån långsamt kan ökas rest tröskeln, så att kanterna för att släppa ut tills mönster framträder. Även om detta tillvägagångssätt är mindre användbar när man letar efter införandet av särskilda noder (t.ex. tillämpning av domänkunskap), gör det möjligt för upptäckten av oväntade relationer med hjälp av StickWRLD som en visUAL analytiskt verktyg för att upptäcka nya mönster i datavisualisering.
StickWRLD begränsas primärt av mängden tillgängligt minne i systemet som det körs samt upplösningen hos displayanordningen. Medan det finns ingen teoretisk gräns för antalet datapunkter StickWRLD kan undersöka, och sekvenser upp till 20.000 positioner har testats i praktiken StickWRLD fungerar bäst med sekvenser upp till ungefär 1000 positioner.
Den främsta fördelen med StickWRLD ligger i dess förmåga att identifiera grupper av rester som samvarierar med varandra. Detta är en betydande fördel jämfört med den traditionella metoden av det statistiska konsensussekvensen, som är en enkel statistisk medelvärdes och tar inte samevolution i beräkningen. Även i vissa fall covarying rester kan helt enkelt vara en artefakt av fylogeni, har även dessa rester motstått "test av val", och som sådan är osannolikt att förringa functionality av varje protein konstruerad för att inkludera dem.
Vid användning StickWRLD att identifiera IPDS i ett kanoniskt DNA- eller proteinsekvens konsensus / motiv före ingenjörs syntetiska varianter kommer att minska risken för fel och stödja snabb optimering av funktion, bör det noteras att StickWRLD kan användas som en generaliserad korrelations identifiering verktyg och är inte begränsad enbart till proteindata. StickWRLD kan användas för att visuellt upptäcka samtidig förekomst av eventuella variabler i någon korrekt kodad datauppsättning.
The authors have nothing to disclose.
StickWRLD was made possible in part through funding provided to Dr. Ray by the Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, and by NSF grant DBI-1262457.
Mac or Ubuntu OS computer | Various | NA | Any Mac or linux (e.g. Ubuntu) computer capable of running python & associated shell scripts |
Python programming language | python.org | NA | Python version 2.7.6 or greater recommended |
wxPython library | wxpython.org | NA | Latest version recommended |
SciPy library | scipy.org | NA | Latest version recommended |
PyOpenGL library | pyopengl.sourceforge.net | NA | Latest version recommended |
StickWRLD Python scripts | NCH BCCM | NA | Available from http://www.stickwrld.org |
fasta2stick.sh file converter | NCH BCCM | NA | Available from http://www.stickwrld.org |
Protein and/or DNA sequence data | NA | NA | Samples available at http://www.stickwrld.org |