Generering av Induced Pluripotent stamceller fra Frozen Buffy Coats bruker Non-integrere episomal Plasmider

Summary

Induserte pluripotente stamceller (iPSCs) representerer en kilde til pasientspesifikke vev for kliniske applikasjoner og grunnforskning. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å omprogrammere humane perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) fra fryste buffy coats inn virusfritt iPSCs med ikke-integrerende episomale plasmider.

Abstract

Somatiske celler kan omprogrammeres til indusert pluripotente stamceller (iPSCs) ved å tvinge ekspresjon av fire transkripsjonsfaktorer (okt-4, Sox-2, KLF-4, og c-myc), vanligvis uttrykt av humane embryonale stamceller (hESCs) . På grunn av deres likhet med hESCs har iPSCs blitt et viktig redskap for potensiell pasient-spesifikke regenerativ medisin, unngå etiske problemstillinger knyttet til hESCs. For å oppnå celler som er egnet for klinisk anvendelse, transgene fritt iPSCs må genereres for å unngå transgenet reaktive, forandret genekspresjon og villedet differensiering. Videre er en svært effektiv og billig metode for omprogrammering er nødvendig for å utlede tilstrekkelig iPSCs for terapeutiske formål. Gitt dette behovet, er en effektiv ikke-integrere episomal plasmid tilnærming til å foretrekke valg for IPSC avledning. Dag den vanligste celletype som brukes til reprogrammerings formål er fibroblaster, isolering av noe som krever vevsbiopsi, en Invasive kirurgisk prosedyre for pasienten. Derfor representerer human perifer blod den mest tilgjengelige og minst invasiv vev for IPSC generasjon.

I denne studien er en kostnadseffektiv og virusfritt protokoll ved bruk av ikke-integrerende episomale plasmider rapportert for generering av iPSCs fra humane perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) oppnådd fra frosne buffy coats etter sentrifugering av fullblod og uten densitetsgradient separasjon.

Introduction

I 2006, gruppen av Shinya Yamanaka ^en demonstrert for første gang at somatiske celler fra voksne mus og mennesker kan konverteres til en pluripotent tilstand ved ektopisk uttrykk for fire omprogrammering faktorer (okt-4, Sox-2, KLF-4, og c-Myc), genererer de såkalte Induced Pluripotent stamceller (iPSCs) ^2. Pasientspesifikke iPSCs ligner menneskelige embryonale stamceller (hESCs) tett i form av morfologi, spredning og evne til å differensiere i hvilke typer tre-bakterie celle (mesoderm, endoderm og ektoderm) mens mangler etiske bekymringer knyttet til bruk av hESCs og forbi mulig immunawisning ^tre. Dermed iPSCs fremstå som en av de viktigste kildene til pasientspesifikke celler for grunnforskning, narkotika screening, sykdom modellering, vurdering av toksisitet, og regenerativ medisin formål ^4.

Flere tilnærminger har vært brukt i IPSC generasjon: virale integrere vektorer(Retrovirus ^5, lentivirus ^6), viral ikke-integrere vektorer (adenovirus ^7), Sendai-virus ⁸ BAC transposoner ^9, episomale vektorer ^10, proteiner ¹¹ eller RNA levering ^12. Selv om bruken av virus-mediert metoder kan føre til høy effektivitet omprogrammering, virale vektorer som integreres i genomet til vertsceller og dermed potensialet tilfeldig insertional mutagenese, kan permanent endring av genekspresjon, og reaktivering av dempede transgener under differensiering ikke utelukkes ^13.

For å gjøre iPSCs tryggere for regenerativ medisin, har man forsøkt å utlede iPSCs uten integrering av eksogent DNA i celle genomer. Selv excisable virale vektorer og transposoner har blitt utviklet, er det fortsatt uklart om korte vektorsekvenser, som uunngåelig forblir i transduserte celler etter fjerning, og transposase uttrykk, kan indusere endringer i celleular fungere ^13. Til tross for sin høye omprogrammering effektivitet, representerer Sendai virus en kostbar tilnærming og nå gjennom lisensiering bekymringer med selskapet som utviklet dette systemet har potensial til å begrense sin søknad i translasjonsforskning studier. Videre er behovet for direkte innføring av proteiner og RNA krever flere levering av omprogrammering molekyler med de iboende tekniske begrensninger Dette innfører, og samlet omprogrammering effektivitet er meget lav ^14. Av notatet, har kostnadseffektive virusfrie og ikke-integrere metoder basert på bruk av episomale plasmider blitt rapportert for omprogrammering av hudfibroblaster ^15. Spesielt i dette arbeidet har vi besluttet å bruke kommersielt tilgjengelige integreringsfritt episomale plasmider, som tidligere rapportert ^10,15.

Til dags dato, hudfibroblaster representerer den mest populære donor celletype ^5. Imidlertid har andre cellekilder vært takkonstruksjonensfully omprogrammeres til iPSCs inkludert keratinocytter ^16, benmarg stamceller ^17, adipose stromaceller ^18, hårsekker ^19, og tannpulpa celler ^20. Isoleringen av disse cellene krever kirurgiske prosedyrer, og flere uker er nødvendig for in vitro celle-ekspansjon for å etablere en primær cellekultur.

I lys av dette, er utvalget av starter celletype kritisk og det er like viktig å kunne produsere iPSCs fra lett tilgjengelige og mindre invasive vev som blod. Begge ledningen blod mononukleære celler (CBMNCs ^21,22) og perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) ^14,22-24 representerer egnede kilder til celler for avledning av iPSCs.

Selv om effektiviteten av voksen PBMNC omprogrammering er 20 til 50 ganger lavere enn for CBMNCs ^22, de forblir den mest praktiske celletypen for prøvetaking formål. IFaktisk har PBMNC sampling fordelen av å være minimalt invasiv, og i tillegg har disse cellene ikke kreve omfattende utvidelse in vitro før omprogrammering eksperimenter. Hittil har forskjellige protokoller rapportert at PBMNCs etter tettshetsgradient separasjon kan fryses og tines dager til flere måneder etter frysing og utvidet for noen dager før omprogrammering inn iPSCs ^22,23. Likevel, så langt vi kjenner ingen rapporter har beskrevet omprogrammering av PBMNCs fra frosne buffy strøk. Viktigere, frosne buffy strøk samles uten tettshetsgradient separasjon representerer de mest vanlige blodprøver som er lagret i stor skala biobanker fra befolkningsstudier, og representerer således en lett tilgjengelig pool av materiale for IPSC produksjon som unngår ytterligere prøvetaking.

Heri rapporterer vi for første gang generering av virusfrie iPSCs fra humane frosne buffy coats, basert på en tidligere beskrevet protokoll ^22. IDessuten ble iPSCs generert fra frosne PBMNCs oppnådd etter tetthetsgradient separasjon, som en kontrollprotokoll for de ikke-tetthetsgradient rensede PBMNC resultater.

Protocol

Perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) ble isolert fra humane perifere prøver av friske donorer etter signert informert samtykke og godkjenning av Etisk komité i provinsen Sør-Tyrol blod. Forsøkene ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Alle data ble samlet inn og analysert anonymt. 1. Isolering av perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) PBMNCs hentet fra buffy strøk etter fullblod sentrifugering, uten densitetsgradient sep…

Representative Results

I denne studien ble en enkel og effektiv protokoll for generering av virusfrie iPSCs ved omprogrammering av PBMNCs isolert fra buffy coats frosne etter sentrifugering av fullblod og sammenligning med omprogrammering av PBMNCs oppnådd etter densitetsgradient separasjon er angitt. Figur 1A viser en skjematisk fremstilling av den detaljerte protokollen. Etter tining de isolerte PBMNCs, som viser en typisk avrundet form, ekspanderes i bestemte blodkulturmedium i 14 dager (figur 1B), og der…

Discussion

I det siste, den eneste måten å få menneskelige pluripotente stamceller som bærer en bestemt genetisk mutasjon var å rekruttere foreldre som gjennomgår pre-implantasjon genetisk diagnose og generere embryonale stamceller fra sine kasserte blastocysts ^31,32. Ved hjelp av en omprogrammering tilnærming, kan forskerne nå generere iPSCs fra pasienter som frakter nesten enhver genotype. Muligheten for å starte fra en pasient-spesifikk cellelinje og en lett tilgjengelig kilde er meget viktig da den tillater…

Materials

Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube	Terumo	VF-054SBCS07
Ammodium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Potassium bicarbonate	Sigma-Aldrich	60339
EDTA disodium powder	Sigma-Aldrich	E5134	0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Life Sciences	17-5442-02	Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)	Gibco	21056-023	No phenol red
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)	Gibco	51500-056	1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031	1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)	PeproTech	300-07	100 ng/ml (Stock:100 µg/ml)
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)	PeproTech	200-03	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)	PeproTech	100-11	40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO)	R&D Systems	287-TC-500	2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin	R&D Systems	2914-HT	100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II	Gibco	11269016	Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1	StemCell Technologies	5850	Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140-050
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010	0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate	Sigma-Aldrich	B5887	0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa	R&D Systems	4114-TC	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503	10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum	Hyclone	SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Merck-Millipore	ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced	BD Biosciences	354230
Collagenase, Type IV	Gibco	17104-019	1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007	Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)	Global Stem	GSC-6201G	1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK	Addgene	27078	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL	Addgene	27080	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP	Addgene	27082	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit	Stemgent	00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody	Merck-Millipore	MAB4304	1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody	Merck-Millipore	MAB4360	1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody	Merck-Millipore	MAB4381	1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-9081	1/500
Anti-Nanog Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-33759	1/500
Anti-Troponin I Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-15368	1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody	Sigma-Aldrich	A7732	1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody	Covance Research Products Inc	MMS-435P-100	1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Calbiochem	657012	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse	Molecular Probes	A-11029	1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit	Molecular Probes	A-21429	1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate	Corning	3471
Trizol Reagent	Ambion	15596-018	reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Invitrogen	11754050	Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	185-5195
Experion Automated Electrophoresis System	Bio-Rad	700-7000	Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit	Bio-Rad	7007105	Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )	Zeiss	495007
NeonTransfection System 100 µL Kit	Invitrogen	MPK10025	Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000	Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit