JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Immunologia e infezioni

Anvende en Inducerbar Expression System til Studieinformationen Interferens med bakteriel virulensfaktorer med intracellulær signalering

Published: June 25, 2015
doi:
10.3791/52903
, , ,
1Department Biologie,Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese,Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut – Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene,Universitätsklinikum Erlangen

Summary

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Abstract

Teknikken præsenteres her tillader en at analysere på hvilket trin et målprotein, eller alternativt et lille molekyle, interagerer med komponenterne i en signalvej. Fremgangsmåden er baseret på den ene side, på den inducerbare ekspression af et specifikt protein til at indlede en signalhændelse ved en defineret og forudbestemt trin i den valgte signaleringskaskaden. Samtidig ekspression, på den anden side, af genet af interesse tillader derefter undersøgeren at vurdere, om aktiviteten af ​​det udtrykte målprotein er placeret opstrøms eller nedstrøms for den indledte signalering begivenhed, afhængigt af udlæsning af signalvejen, som opnås. Her blev den apoptotiske kaskade udvalgt som defineret signalvej at påvise protokol funktionalitet. Patogene bakterier, såsom Coxiella burnetii, translokere effektor proteiner som interfererer med værten celledødsinduktion i værtscellen for at sikre bakteriel overlevelse i cellen og til at fremme deresudbredelse i organismen. C. burnetii effektor-protein CaeB effektivt inhiberer vært celledød efter induktion af apoptose med UV-lys eller med staurosporin. At indsnævre hvor trin CaeB forstyrrer udbredelsen af ​​den apoptotiske signal, blev udvalgte proteiner med velkarakteriserede pro-apoptotiske aktivitet udtrykkes transient i en doxycyclin-inducerbar måde. Hvis CaeB virker opstrøms for disse proteiner, vil apoptose fortsætte uhindret. Hvis CaeB virker nedstrøms, vil celledød inhiberes. Testproteinerne udvalgte var Bax, der virker på niveauet for mitokondrierne, og caspase 3, som er den største bøddel protease. CaeB forstyrrer celledød induceret af Bax-ekspression, men ikke af caspase 3-ekspression. CaeB således interagerer med den apoptotiske kaskade mellem disse to proteiner.

Introduction

Virulensen af ​​mange Gram-negative bakterielle patogener afhænger specialiserede sekretionssystemer at kapre eukaryote værtsceller. Bakterier bruger disse sekretionssystemer at injicere bakterielle virulens proteiner (effektorer) ind i værtscellen til at modulere en række cellulære og biokemiske aktiviteter. Studiet af effektor proteiner har ikke kun givet bemærkelsesværdige indsigt i grundlæggende aspekter af vært / patogen interaktioner, men også ind i den grundlæggende biologi eukaryote celler 1. Modulering af værtscelle apoptose har vist sig at være en vigtig virulens mekanisme for mange intracellulære patogener, og en række effektorproteiner modulerende apoptose er blevet identificeret 2-9. Men deres nøjagtige molekylære mekanismer for aktivitet forbliver undvigende i mange tilfælde.

Apoptose, en form for programmeret celledød, spiller en vigtig rolle i immunresponser på infektion 10. To vigtige veje, der fører til apoptose harblevet identificeret: målretning mitokondrierne (intrinsisk apoptose) eller direkte transduktion af signalet via celledød-receptorer på plasmamembranen (extrinsic apoptose). Den iboende eller mitokondrier-medieret celledød pathway udløses af intracellulære signaler og involverer aktiveringen af ​​Bax og Bak, to pro-apoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien. Denne familie består af pro- og anti-apoptotiske regulator proteiner, der styrer celledød 11-14. Aktivering af apoptose fører til oligomerisering af Bax og Bak efterfulgt af efterfølgende permeabilisering af den mitokondriske ydre membran, hvilket resulterer i cytochrom c-frigivelse i cytoplasmaet. Cytochrom C frigivelse initierer aktivering af effektor-caspaserne 3 og 7 gennem aktivering af caspase 9 i apoptosome 15. Dette fører til proteolyse af udvalgte substrater, der blandt andet resulterer i eksponeringen af phosphatidylserin på celleoverfladen 16 og frigør en dedikeret DNase at fragmenter chromatin 17,18.

For at afgøre, hvor i den apoptotiske kaskade en individuel effektor-protein interfererer blev et inducerbart ekspressionssystem 19. Reguleringssystemer til betinget udtryk af transgener har været et uvurderligt værktøj i at analysere et proteins funktion i cellen eller dens betydning for væv, orgel og organisme udvikling, samt under initiering, progression og vedligeholdelse af sygdom 20-23. Typisk inducerbare kontrolsystemer, såsom Tet-systemet 24 anvendes her, danner en kunstig transkriptionsenhed (se figur 1). En komponent er et kunstigt manipuleret transkriptionsfaktor kaldet tTA (tetracyclin-afhængig transskription aktivator), dannet ved fusion af det bakterielle transkription repressor TetR 25 til et pattedyrprotein domæne, som medierer transkriptionel aktivering eller silencing 24,26. Den anden komponent er en hybridpromotor, betegnet TRE (tetracyklin-responsivt element), der består af en eukaryot minimal promotor, der indeholder mindst en TATA-box og et transskriptionsinitieringssted, forbundet til flere gentagelser af beslægtede DNA-bindingssted for TetR, tetO 24,25. Den tredje komponent er den naturlige ligand af TetR, tetracyclin eller et af dets derivater, såsom anhydrotetracycline eller doxycyklin 25. Efter ligand tilsætning til dyrkningsmediet, TetR mister dets affinitet for tetO og dissocierer fra TRE. Som følge heraf er transkription af målgenet afskaffet. Transgen ekspression kan således blive tæt kontrolleret på en tids- og dosisafhængig måde i både cellekultur og i dyr 20,23,24. Med tTA, transgen ekspression forekommer konstitutivt, undtagen i nærvær af en tetracyclin. Dette kan være en ulempe i studiet af cytotoksiske eller onkogene proteiner, fordi tetracyclin først skal fjernes fra systemet, før transgen expression forekommer, og målproteinet virkninger på cellen kan overvåges. Dette kan være tidskrævende og er ikke altid fuldstændig, især i transgene dyr 27. For at løse denne begrænsning blev en TetR mutant med en invers reaktion på tilstedeværelsen af doxycyclin anvendes til at generere en ny transkriptionsfaktor, rtTA (revers tTA) 28. Det binder kun til TRE og, samtidigt, aktiverer transkription i nærvær af doxycyclin. Resterende utæthed i systemet, dvs.., Transgenekspression i fravær af TRE-bundet transkriptionsfaktor, oprindelse enten (i) fra positionseffekter på et genomisk integration site, (ii) fra TRE selv 29, eller (iii) fra ikke -specifikke binding af tTA / rtTA 28, blev behandlet ved at indføre en yderligere transkriptionel lyddæmper, betegnet TTS (tetracyclin-afhængig transskriptionel lyddæmper) 30 til systemet. Det danner et dobbelt regulator nettet sammen med rtTA (se figur 1).I mangel af doxycyclin, TTS bindes til TRE og aktivt lukker ned resterende transskription. I nærvær af doxycyclin, TTS dissocierer fra TRE og rtTA binder samtidigt inducere ekspression af målgenet. Dette ekstra lag af stringens er ofte nødvendigt at udtrykke meget aktive cytotoksiske proteiner 31-34.

Brug af denne tæt kontrolleret dobbelt regulator system kan initieres den apoptotiske kaskade ved en defineret trin tillader analyse af, om den givne effektor-protein kan interferere med apoptose induktion. Denne metode kan ikke kun anvendes til at studere den anti-apoptotiske aktivitet af bakterielle effektor proteiner, men også for den inducerbare ekspression af pro-apoptotiske eller toksiske proteiner eller til dissekere interferens med andre signalveje.

Protocol

1. Generering af stabile cellelinjer, der udtrykker proteinet af interesse Forbered medier ved tilsætning varmeinaktiveret FCS og 1% penicillin / streptomycin til kommercielt tilgængelige Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med GlutaMAX-I, pyruvat og 4,5 g / l D-glucose. Dyrk HEK293-celler i medier ved 37 ° C i 5% CO2. Sub-dyrke celler hver tredje dag. Fjern mediet og resuspender cellerne i 15 ml frisk medie. Pipette 1 ml i en ny 75 cm2 cellekultur kolbe og tils?…

Representative Results

Først blev HEK293 cellelinjer der stabilt udtrykker proteinet af interesse (CaeB) som GFP-fusionsprotein etableret. Som en kontrol blev HEK293-cellelinjer, der stabilt udtrykker GFP også genereret. Ekspression af GFP og GFP-CaeB blev verificeret ved immunoblot-analyse. Den repræsentative immunoblot (figur 4A), viser stabil og klart påviselig ekspression af GFP og GFP-CaeB. Dog kan denne analyse ikke afgøre, om alle celler udtrykker GFP eller GFP-CaeB. Derfor blev stabilt transficerede HEK293 cellel…

Discussion

Mange patogene bakterier harbor sekretionssystemer til at udskille eller translokere bakterielle effektor proteiner i værtscellen. Disse effektor proteiner har evnen til at modulere processer og veje i værtscellen, hvilket tillader bakterier at overleve og formere sig i deres respektive intracellulære niche. Forståelse af de biokemiske aktiviteter og de molekylære mekanismer i de effektor proteiner vil hjælpe til en bedre forståelse af patogenicitet og kan bidrage til at udvikle nye terapeutiske redskaber til at …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

Materials

DMEM life technologies 31966-021
FCS Biochrom S0115
Pen/Strep life technologies 15140-122
OptiMEM life technologies 51985
X-tremeGENE 9 Roche 6365752001
Geneticin Roth CP11.3
Polyethylenimine Polyscienes 23966
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 170-3940
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26616
PVDF membrane Millipore IPVH00010
anti-GFP  life technologies A6455
anti-cleaved PARP BD Bioscience 611038
anti-actin Sigma Aldrich A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-045
ECL Western Blotting Substrate Thermo Scientific 32106
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 46428
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
  2. Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
  3. Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
  4. Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
  5. Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
  6. Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
  7. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
  8. Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
  9. Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
  10. Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
  11. Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
  12. Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
  13. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
  14. Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
  15. Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
  16. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
  17. Cory, S. Cell death throes. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).
  18. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
  19. Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
  20. Felsher, D. W. Reversibility of oncogene-induced cancer. Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).
  21. Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
  22. Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
  23. Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
  24. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  25. Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
  26. Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).
  27. Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
  28. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
  29. Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
  30. Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
  31. Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
  32. Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
  33. Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
  34. Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
  35. Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
  36. Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
  37. Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
  38. Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
  39. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  40. Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
  41. Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
  42. Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
  43. Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
  44. Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
  45. Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
  46. Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).

Tags

Inducible Expression SystemBacterial Virulence FactorsIntracellular SignalingApoptotic CascadeCoxiella BurnetiiCaeB Effector ProteinBaxCaspase 3Cell DeathSignaling PathwayProtein Interaction
check_url/it/52903?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck, L., Lührmann, A. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (100), e52903, doi:10.3791/52903 (2015).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image