誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、
Summary
The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.
Abstract
ここに提示された技術は、いずれかの標的タンパク質、あるいは小分子ステップれる分析することができ、シグナル伝達経路の構成要素と相互作用します。この方法は、選択されたシグナル伝達カスケードで定義され、所定のステップでシグナル伝達事象を開始するために、一方では、特定のタンパク質の誘導性発現に基づいています。一方、目的の遺伝子の同時発現は、その後発現される標的タンパク質の活性が上流または開始シグナル伝達事象の下流で、得られたシグナル伝達経路の読み出しに依存する場合、治験責任医師が評価することができます。ここでは、アポトーシスカスケードは、プロトコル機能性を実証するために定義されたシグナル伝達経路として選択しました。例えば、 コクシエラバーネッティなどの病原性細菌は、細胞内の細菌の生存を確保するために、それらのを促進するために宿主細胞において、宿主細胞死の誘導を妨害するエフェクタータンパク質を転生物における普及。 C.バーネッティエフェクタータンパク質CaeBを効果UV光を伴うまたはスタウロスポリンでのアポトーシスの誘導後に宿主細胞の死を阻害します。 CaeBはアポトーシスシグナルの伝達を妨害するステップで絞り込むには、十分に特徴付けられたプロアポトーシス活性を有する選択されたタンパク質は、ドキシサイクリン誘導性の方法で一時的に発現させました。 CaeBはこれらのタンパク質の上流に作用する場合、アポトーシスが妨害されずに続行されます。 CaeB下流に作用する場合、細胞死が阻害されます。選択した試験タンパク質は、主要な執行プロテアーゼであるミトコンドリアのレベルで作用バックス、およびカスパーゼ3でした。 CaeBはBax発現により誘導される細胞死を妨害ではなく、カスパーゼ3発現による。 CaeBは、したがって、これら2つのタンパク質間のアポトーシスカスケードと相互作用します。
Introduction
多くのグラム陰性細菌病原体の毒性は、真核生物宿主細胞をハイジャックするための特殊な分泌系に依存します。細菌は細胞および生化学のさまざまな活動を調節するために宿主細胞への細菌の病原性タンパク質（エフェクター）を注入するために、これらの分泌系を使用しています。エフェクタータンパク質の研究では、ホスト/病原体相互作用の基本的な側面にも真核細胞1の基本的な生物学に顕著な洞察を提供しているだけではなく。宿主細胞のアポトーシスの調節は、多くの細胞内病原体のための重要な病原性機構であることが示されており、アポトーシスを調節するエフェクタータンパク質の数は2-9同定されています。しかし、活性のそれらの正確な分子機構は、多くの場合、とらえどころのないままです。
アポトーシス、プログラム細胞死の形態は、感染10に対する免疫応答に重要な役割を果たしています。アポトーシスに導く二つの主要な経路は、持っています特定されて：原形質膜（外因性アポトーシス）で細胞死受容体を介したミトコンドリア（内因性アポトーシス）または信号の直接伝達を標的とします。真性またはミトコンドリア媒介性の細胞死経路は、細胞内シグナルによってトリガーされ、BaxおよびBakの、のBcl-2ファミリーの2プロアポトーシスメンバーの活性化が関与しているされています。このファミリーは、細胞死を制御11-14プロおよび抗アポトーシス調節タンパク質で構成されています。アポトーシスの活性化はBaxおよびBakののオリゴマー化につながる細胞質へのシトクロムCの放出をもたらす、ミトコンドリア外膜のその後の透過処理が続きます。シトクロムcの放出は、アポトソーム15におけるカスパーゼ9の活性化を介してエフェクターカスパーゼ3および7の活性化を開始します。これは、とりわけ、細胞表面16上のホスファチジルセリンの暴露をもたらす、選択された基質のタンパク質分解をもたらし、CHをフラグメント専用のDNアーゼを解放します17,18 romatin。
アポトーシスカスケード内の個々のエフェクタータンパク質が干渉を決定するために、誘導可能な発現系は19を使用しました。導入遺伝子の条件式のための規制システムは、細胞内のタンパク質の機能や組織、器官および生物開発のための重要性だけでなく、開始、進行および疾患20-23のメンテナンス時の解析に貴重なツールとなっています。典型的には、このようなここで使用のTetシステム24と誘導制御システムは、（ 図1参照）人工的な転写単位を形成します。一方の成分は、転写活性化または24,26のサイレンシングを媒介する哺乳動物タンパク質ドメインに細菌転写抑制のTetR 25の融合によって形成されたtTA（テトラサイクリン依存性転写活性化因子）と呼ばれる人工的に操作した転写因子を、あります。第二成分は、ハイブリッドでありますプロモーター、真核生物の最小プロモーターからなる、TRE（テトラサイクリン応答性エレメント）と呼ばれる、少なくともTATAボックスおよび転写開始部位を含む、のTetR、 のtetO 24,25用の同族のDNA結合部位の複数の反復に接合。第三成分がのTetR、テトラサイクリンまたはそのようなアンヒドロやドキシサイクリン25その誘導体、の1の天然リガンドです。培地へのリガンドを添加すると、のTetRはのtetOに対するその親和性を失い、TREから解離します。その結果、標的遺伝子の転写が廃止されています。導入遺伝子の発現は、このように、しっかりと両方の細胞培養および動物20,23,24における時間および用量依存的に制御することができます。 tTAをして、導入遺伝子の発現は、テトラサイクリンの存在を除いて、構成的に発生します。テトラサイクリンは、最初の導入遺伝子の前に、システムから除去されなければならないので、これは細胞毒性または発癌性タンパク質の研究で不利であることができるexpressionが起こると、細胞上の標的タンパク質の効果をモニターすることができます。これは時間がかかり、特にトランスジェニック動物において、常に27完了していないことができます。この制限に対処するために、ドキシサイクリンの存在に逆応答とのTetR変異体は、新しい転写因子を生成するために使用された、rtTAの28（tTAをリバース）。それはTREに結合し、同時に、ドキシサイクリンの存在下で転写を活性化するのみ。残留システムの漏れやすさ、 すなわち 、TRE結合転写因子の非存在下での導入遺伝子の発現は、ゲノム組み込み部位での位置効果から（I）のいずれかを発信し、（ii）のTRE自身29、または（iii）からの非から固有のtTA / rtTAの28の結合、追加の転写サイレンサーを導入することによって対処された、システムに（テトラサイクリン依存性転写サイレンサー）30のtTSと呼ばれます。これは、rtTAの（ 図1参照）と一緒に二重の調節ネットワークを形成します。ドキシサイクリンの非存在下では、TTSはTREに結合し、積極的に残りの転写をシャットダウンします。ドキシサイクリンの存在下では、TTSはTREから解離したrtTAを同時に標的遺伝子の発現を誘導結合します。ストリンジェンシーのこの追加の層は、高活性の細胞毒性タンパク質31〜34を発現することがしばしば必要です。
この厳密に制御デュアルレギュレータ方式を使用して、アポトーシスカスケードは、与えられたエフェクタータンパク質は、アポトーシス誘導を妨害することができるかどうかの分析を可能にする定義された段階で開始することができます。この方法は、細菌のエフェクタータンパク質の抗アポトーシス活性を研究するために使用されるだけでなく、プロアポトーシスまたは毒性タンパク質の誘導性発現のために、または他のシグナル伝達経路との干渉を解剖するためのすることはできません。
Protocol
Representative Results
Discussion
多くの病原性細菌は、宿主細胞への細菌のエフェクタータンパク質の分泌または転位する分泌系を保有します。これらのエフェクタータンパク質は、細菌が生存し、それらのそれぞれの細胞内ニッチ内で複製することができ、宿主細胞内でプロセスおよび経路を調節する能力を有します。生化学的活性およびエフェクタータンパク質の分子機構を理解することは、病原性のより良い理解に向?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.
Materials
| DMEM | life technologies | 31966-021 | |
| FCS | Biochrom | S0115 | |
| Pen/Strep | life technologies | 15140-122 | |
| OptiMEM | life technologies | 51985 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
| Geneticin | Roth | CP11.3 | |
| Polyethylenimine | Polyscienes | 23966 | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 170-3940 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| anti-GFP | life technologies | A6455 | |
| anti-cleaved PARP | BD Bioscience | 611038 | |
| anti-actin | Sigma Aldrich | A2066 | |
| Mouse IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
| Rabbit IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| Restore Plus Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46428 |
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