الحث المباشر للمكون للدم البطانة Endothelium والدم عن طريق overexpression من العوامل المحفزة النسخ في الإنسان الخلايا الجذعية
Summary
This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.
Abstract
خلال التنمية، تنشأ الخلايا المكونة للدم من مجموعة فرعية متخصصة من الخلايا البطانية، البطانة مكون للدم (HE). تطوير النمذجة سعادة في المختبر أمر ضروري للدراسات الميكانيكية للانتقال-البطانية المكونة للدم ومواصفات المكونة للدم. هنا، نحن تصف طريقة لتحريض الفعال للسعادة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) عن طريق overexpression من مجموعات مختلفة من عوامل النسخ. يتم استخدام مزيج من ETV2 وGATA1 أو GATA2 TFS للحث على سعادة مع إمكانية عموم الدم النخاعي، في حين أن مجموعة من GATA2 وعوامل النسخ TAL1 يسمح لإنتاج سعادة مع محمر وإمكانات النواءات. إضافة إلى LMO2 GATA2 والجمع بين TAL1 يسرع إلى حد كبير التمايز ويزيد إنتاج خلايا محمر والنواءات. يوفر هذا الأسلوب وسيلة فعالة وسريعة لسعادة تحريض من hPSCs ويسمح لمراقبة البطانية-hematopoietiج الانتقالية في صحن الثقافة. ويتضمن البروتوكول إجراءات hPSCs تنبيغ وتحليل ما بعد تنبيغ معالي والأسلاف الدم.
Introduction
قدرة فريدة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) لتجديد الذات والتمايز إلى خلايا الطبقات الجرثومية الثلاث، بما في ذلك الدم، وجعلها أداة قيمة للدراسات الميكانيكية للتنمية المكونة للدم، والنمذجة من أمراض الدم، وفحص المخدرات، دراسات السمية، وتطوير العلاجات الخلوية. لأن تشكيل الدم في العائدات الجنين من البطانة مكون للدم (HE) من خلال الانتقال للدم البطانية 1،2، وتوليد سعادة في الثقافات سيكون ضروريا لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم البطانية إلى الانتقال للدم ومواصفات المكونة للدم. وتستند الأساليب الحالية للدراسات سعادة على تحريض التمايز hematoendothelial في المجاميع (EBS) مع إضافة السيتوكينات المكونة للدم 3-5، وcoculture من hPSCs مع خلايا انسجة-تكون الدم داعمة 6،7 أو في الثقافات ثنائية الأبعاد مع خارج الخلية المصفوفات وجytokines 8،9. وتستند هذه الأساليب التمايز الكلاسيكية على إدخال الإشارات الخارجية المؤثرة على سطح الخلية وبدء مجموعات من المسارات الجزيئية التي تؤدي في نهاية المطاف إلى تفعيل برنامج النسخي توجيه التنمية hematoendothelial. وهكذا، فإن كفاءة hPSCs التفرقة في هذه الأنظمة تعتمد على الاستقراء الفعال لتلك الإشارات، نقل الإشارة إلى النواة، وتفعيل الناتجة من المنظمين النسخي محددة. وبالإضافة إلى ذلك، ودراسة سعادة في الثقافات التمايز التقليدية تتطلب خطوة إضافية لعزل سعادة الخلايا باستخدام فرز الخلايا. هنا، نحن تصف بروتوكول بسيط للتحريض مباشر من معالي والدم عن طريق overexpression من عوامل النسخ المكونة للدم. يسمح هذا الأسلوب للتحريض الفعال للسعادة في طبق والملاحظة المباشرة من البطانية على الانتقال للدم دون الحاجة لعزل سعادة باستخدام إجراء فرز الخلايا المرهقة.
تشكيل معالي والدم من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان يمكن أن يتسبب بكفاءة عن طريق overexpressing عدد قليل من عوامل النسخ (TFS). الجمع الأمثل للTFS قادرة على إحداث قوية على عموم النخاعي تكون الدم من hPSCs يشمل ETV2 وGATA1 أو GATA2. في المقابل، مزيج من GATA2 وTAL1 يدفع erythromegakaryocytopoiesis 10. برمجة hPSCs من خلال overexpression من هذه العوامل يفرق hPSCs مباشرة إلى VE-نذل + CD43 – CD73 – سعادة الخلايا التي يكتسب تدريجيا النمط الظاهري للدم الذي حدده التعبير في وقت مبكر للدم علامة CD43 7. هذا الأسلوب القائم على lentiviral للبرمجة مباشرة لالبشري المحفزة طريقة الخلايا الجذعية ينطبق على الجيل معالي وخلايا الدم للدراسات الميكانيكية، دراسات البطانية إلى الانتقال للدم، وتنظيم النسخي التنمية المكونة للدم والمواصفات. على الرغم من أن جيصف بروتوكول urrent إنتاج الدم باستخدام التعبير التأسيسي للالجينات المحورة، يمكن الحصول على نتائج مماثلة باستخدام تعديل مرنا 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة المبين أعلاه للدم تمايز hPSCs التي كتبها overexpression من TFS، يمثل نهجا السريع والفعال للجيل معالي والنخاعي وerytho magakaryocytic الأسلاف من hESCs وiPSCs، مما يسمح للإنتاجية تصل إلى 30 ملايين خلايا الدم من مليون الخلايا الجذعية المحفزة 10. هذه الطريقة تعرض التمايز المستمر في عدة…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.
Materials
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture.
| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ –>3’ | Reverse (Rev) 5’–>3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | — | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | — | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | — | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | — | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | — | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | — | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
Riferimenti
- Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
- Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).
- Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21, 31-41 (2004).
- Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121 (5), 770-780 (2012).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 553-567 (2012).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108, 2095-2105 (2006).
- Wang, C., et al. TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy. Cell Res. 22, 194-207 (2012).
- Uenishi, G., et al. Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6 (2007).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).
