Induction directe de Hemogenic endothélium et le sang par la surexpression de facteurs de transcription dans pluripotentes humaines Cellules souches

Summary

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

Abstract

Au cours du développement, les cellules hématopoïétiques proviennent de un sous-ensemble spécialisé de cellules endothéliales, l'endothélium hemogenic (HE). Modélisation HE développement in vitro est essentiel pour des études mécanistiques de la transition de l'endothélium hématopoïétiques et la spécification hématopoïétique. Ici, nous décrivons un procédé efficace pour l'induction de IL partir de cellules humaines pluripotentes de troncs (hPSCs) au moyen de la surexpression de différents ensembles de facteurs de transcription. La combinaison de ETV2 et GATA1 ou GATA2 TF est utilisé pour induire un potentiel SE pan-myéloïde, tandis qu'une combinaison de GATA2 et des facteurs de transcription TAL1 permet la production de IL avec érythroïde et mégacaryocytaire potentiel. L'ajout de LMO2 à GATA2 et la combinaison TAL1 accélère sensiblement la différenciation érythroïde et augmente et les cellules mégacaryocytaires production. Cette méthode offre un moyen efficace et rapide de SE l'induction de hPSCs et permet l'observation de l'endothélium hematopoietic transition dans une boîte de culture. Le protocole comprend des procédures hPSCs de transduction et l'analyse post-transduction de SE et des progéniteurs sanguins.

Introduction

La capacité unique de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) d'auto-renouvellement et de se différencier en cellules des trois feuillets embryonnaires, y compris le sang, faire un outil précieux pour les études mécanistiques de développement hématopoïétique, la modélisation des maladies du sang, le dépistage des drogues, Les études de toxicité et le développement de thérapies cellulaires. Parce que la formation du sang dans l'embryon produit à partir de l'endothélium hemogenic (HE) à travers une transition hématopoïétique endothéliale ^1,2, la génération de SE dans les cultures serait essentiel d'étudier les mécanismes moléculaires régulant l'endothélium à la transition hématopoïétiques et la spécification hématopoïétique. Les méthodes actuelles pour les études de SE sont basés sur l'induction de la différenciation dans les agrégats hematoendothelial (EBS) avec l'ajout de cytokines hématopoïétiques ^3-5, et de co-culture avec des cellules hPSCs stromales ^{hématopoïèse-6,7} de soutien ou dans des cultures en deux dimensions avec extracellulaire et c matricesytokines ^8,9. Ces méthodes classiques de différenciation sont basées sur l'introduction de signaux externes agissant à la surface de la cellule et d'initier des cascades de voies moléculaires qui conduisent finalement à l'activation du programme de transcription orienter le développement hematoendothelial. Ainsi, l'efficacité de hPSCs différenciations dans ces systèmes repose sur une induction efficace de ces signaux, la transduction du signal vers le noyau, et l'activation résultant de régulateurs transcriptionnels spécifiques. En outre, l'étude de SE dans les cultures de différenciation classiques nécessite l'étape supplémentaire consistant à isoler des cellules SE en utilisant le tri de cellules. Ici, nous décrivons un protocole simple pour l'induction directe de SE et de sang par la surexpression de facteurs de transcription hématopoïétiques. Cette méthode permet l'induction efficace de SE dans un plat et l'observation directe de l'endothélium à la transition hématopoïétique, sans la nécessité pour l'isolation des SE en utilisant une procédure de tri cellulaire encombrant.

Formation de SE et de sang à partir de cellules souches pluripotentes humaines peuvent être efficacement induites par la surexpression seulement quelques facteurs de transcription (FT). La combinaison optimale de TFS capables d'induire robuste hématopoïèse pan-myéloïde de hPSCs comprend ETV2 et GATA1 ou GATA2. En revanche, la combinaison de GATA2 et TAL1 induit erythromegakaryocytopoiesis ^10. Programmation hPSCs par la surexpression de ces facteurs différencie hPSCs directement à la VE-cad ⁺ CD43 ^– CD73 ^– HE cellules qui acquièrent progressivement le phénotype hématopoïétique défini par l'expression du début hématopoïétiques CD43 marqueur ^7. Cette méthode basée lentivirus pour la programmation directe de pluripotentes méthode des cellules souches humaines est applicable pour la génération de SE et de cellules sanguines pour des études mécanistes, des études de l'endothélium à la transition hématopoïétique, et la régulation transcriptionnelle du développement hématopoïétique et la spécification. Bien que le cprotocole de dusyst décrit la production de sang en utilisant une expression constitutive des transgènes, des résultats similaires pourraient être obtenus en utilisant l'ARNm modifié ^10.

Protocol

1. préparations de virus et facteur de transcription Combinaisons Préparer des solutions avec pSIN EF1-lentiviral plasmide d'expression contenant l'ADN codant pour la protéine de ETV2, GATA1, GATA2, LMO2 et TAL1 (tableau 1). Mesurer la concentration et la pureté des préparations de plasmides utilisés pour la production lentiviral enregistrement par absorption UV avec un spectrophotomètre à 230 nm, 260 nm et 280 nm. Note: préparations d'ADN démontrant A26…

Representative Results

Le schéma de SE et l'induction de sang de hPSCs par la surexpression de facteurs de transcription est montré dans la figure 1. ETV2 avec GATA1 ou GATA2 combinaison induit hématopoïèse pan-myéloïde, tandis qu'un GATA2, TAL1 +/- combinaison LMO2 induit hématopoïèse principalement érythro-mégacaryocytaire. Les deux combinaisons de TF directement induites cellules ES qui ont transformé ensuite en progéniteurs sanguins avec un spectre distinct de la différenciation hé…

Discussion

La méthode décrite ci-dessus pour la différenciation hématopoïétique de hPSCs par la surexpression de TFS, représente une approche rapide et efficace pour la génération de SE et myéloïdes et erytho-magakaryocytic progéniteurs de CSEh et CSPi, permettant ainsi la production de jusqu'à 30 millions de cellules de sang de un million de cellules souches pluripotentes ^10. Cette méthode présentait différenciation cohérente dans de multiples lignées de CSEh et CISP ^10. Au cours de la …

Materials

Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.

pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61061	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61063	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61064	Lentiviral Vector
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Cationic polymer used to increase the efficiency of infection
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302	RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01	Cell Dissociation Reagent
Incomplete (growth factor- free) culture medium                                              mTeSR1 Custom formulation	WiCell Research Institute (Madison, WI)	MCF	Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb
human SCF	Peprotech	300-07	Premium grade
human TPO	Peprotech	300-18	Research grade
human FGF-basic	Peprotech	100-18B	Premium grade
CD144 (VE-cad) FITC	BD Biosciences	560411	Endothelial marker (FACS)
CD226 PE	BD Biosciences	338305	Hematopoietic (FACS)
CD43 PE	BD Biosciences	560199	Hematopoietic (FACS)
CD73 APC	R&D Systems	FAB5795A	Endothelial marker (FACS)
CD45 APC	BD Biosciences	555485	Hematopoietic (FACS)
7AAD	Life Technologies	A1310	Live/Dead assay (FACS)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Cell fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	Permeabilization
FBS	Fisher Scientific	SH3007003	Fetal bovine serum
Mouse anti-human CD43	BD Biosciences	551457	Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining
Rabbit anti-human VE-cadherin	BenderMedSystem	BMS158	Primary (IF)
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated	JacksonResearch	715-486-152	Secondary (IF)
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated	JacksonResearch	715-516-150	Secondary (IF)
DAPI nucleic acid stain	Life Technologies	D1306	Live/Dead assay (IF)
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	4435	CFC-assay
Wright Stain solution	Sigma -Aldrich	32857	Staining cytospins

Table 2. hPSCs culture.

Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)	WiCell Research Institute (Madison, WI)	hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells	hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers
Complete serum-free medium for culture of hPSCs                                                    mTeSR1 media	WiCell Research Institute (Madison, WI)	M500	Serum-free  medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs
Matrigel	BD Biosciences/ Corning	356234	Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs
DMEM/F-12, powder	Life Technologies	12500-062	Basal Medium
HyClone Dulbecco's PBS powder	Fisher Scientific	dSH30013.04	PBS
Dispase II, powder	Life Technologies	17105-041	Neutral protease, Cell dissociation

Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.

Primer's Name	Forward (Fwd)  5’ –>3’	Reverse (Rev) 5’–>3’	Discription
pSIN EF1a Fwd	TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA	—	EF1a promoter sequence
GATA1 Rev	—	TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC	Coding Region
GATA2 Rev	—	GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG	Coding Region
TAL1 Rev	—	AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT	Coding Region
LMO2 Rev	—	GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC	Coding Region
ETV2 Rev	—	GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC	Coding Region