인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액
Summary
This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.
Abstract
개발하는 동안, 조혈 세포가 혈관 내피 세포의 전문 집합에서 발생, hemogenic 내피 (HE). 체외에서 모델링 HE 개발은 내피 – 조혈 전환 및 조혈 사양의 기계 론적 연구에 필수적이다. 여기서, 우리는 전사 인자의 다른 세트의 과발현로서 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)로부터 HE의 효율적인 유도하는 방법을 설명한다. GATA2 TAL1 및 전사 인자의 결합은 적혈구 및 거핵 세포 가능성 HE의 생성을 허용하면서 ETV2 및 GATA1 또는 GATA2과 TF들의 조합은 팬 – 골수 가능성 HE를 유도하기 위해 사용된다. GATA2 및 TAL1 조합에 LMO2의 추가는 실질적으로 차별화를 가속화하고 적혈구와 거핵 세포 세포의 생산을 증가시킨다. 이 방법에서 hPSCs HE 유도 효율적이고 빠른 방법을 제공하고 내피 hematopoieti의 관찰을 허용배양 접시에서 C 전환. 이 프로토콜은 hPSCs 전달 절차 및 HE의 후 전달 분석 및 혈액 전구 세포를 포함한다.
Introduction
자기 갱신과 혈액을 포함한 세 가지 배엽의 세포로 분화하는 조혈 개발의 역학적 연구에 그들에게 가치있는 도구를 만들어, 혈액 질환의 모델링, 약물 검사에 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)의 독특한 능력, 독성 연구 및 세포 요법의 개발. 내피 조혈 전환 1, 2를 통해 (HE) hemogenic 내피 세포에서 배아 진행 혈액 형성, 문화 HE의 발생 조혈 전환 및 조혈 사양 내피 조절 분자 메커니즘을 연구하는 것이 필수적 것 때문에. 그는 연구에 대한 현재의 방법은 조혈-지지 기질 세포 6,7 또는 세포 외 두 개의 차원 문화 hPSCs의 조혈 사이토 카인 3-5의 추가와 골재 (사채)에서 hematoendothelial 분화 유도 및 공 배양을 기반으로 행렬과 C8,9 ytokines. 이러한 고전 분화 방법은 세포 표면에서 작용하는 결국 hematoendothelial 개발을 유도 전사 프로그램의 활성화로 이어질 분자 경로 캐스케이드를 개시하는 외부 신호의 도입에 기초한다. 따라서, 이러한 시스템에서의 분화 hPSCs의 효율은 그 신호의 효과적인 유도 핵 신호 전달 및 특정 전사 레귤레이터 얻어진 활성화에 의존한다. 또한, 기존의 분화 배양 년의 연구는 세포 정렬을 사용하여 HE에게 세포를 분리하는 추가 단계가 필요합니다. 여기, 우리는 조혈 전사 인자의 과발현에 의해 그와 혈액의 직접 유도를위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 복잡 셀 정렬 절차를 사용하여 HE의 분리를위한 필요없이 요리와 조혈 전환에 내피의 직접 관찰 년의 효율적인 유도 할 수 있습니다.
인간 만능 줄기 세포에서 HE의 형성과 혈액을 효율적으로 몇 전사 인자 (TFS)를 과발현에 의해 유도 될 수있다. hPSCs에서 강력한 팬 골수 조혈을 유도 할 수있는과 TF의 최적 조합은 ETV2 및 GATA1 또는 GATA2을 포함한다. 대조적으로, GATA2 및 TAL1의 조합 erythromegakaryocytopoiesis 10을 유도한다. CD73 – – 점차적으로 초기 조혈 마커 CD43 (7)의 발현에 의해 정의 된 조혈 표현형을 획득 그는 세포 이러한 요소의 과발현을 통해 hPSCs를 프로그래밍 직접에 hPSCs가 VE-CAD + CD43을 구별합니다. 인간 다 능성 줄기 세포에있어서의 직접 프로그래밍이 렌티 기반 방법은 역학적 연구 조혈 전이 내피에 대한 연구, 개발 및 조혈 및 명세서의 전사 조절을위한 HE 및 혈액 세포의 생성에 적용 할 수있다. C 있지만urrent 프로토콜은 유사한 결과가 수정 10의 mRNA를 사용하여 얻을 수 있었다 유전자의 구성 적 발현을 이용한 혈액 생산을 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
TF가의 과발현 hPSCs의 조혈 분화 상기 방법은 인간 배아 줄기 세포 및 이에 최대 30 수백만 혈액 세포의 생산에서 허용 iPSCs로부터 HE 및 골수와 erytho-magakaryocytic 전구 세포의 생성을위한 빠르고 효과적인 방법을 나타낸다 백만 만능 줄기 세포 (10). 이 방법은 다수의 hESC iPSCs 및 라인 (10)에 일관된 분화를 나타내었다. ETV2 및 GATA2로 분화하는 동안, GATA1 요인뿐만 아니라 GATA2 및 TAL1 요인,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.
Materials
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture.
| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ –>3’ | Reverse (Rev) 5’–>3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | — | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | — | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | — | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | — | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | — | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | — | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
Riferimenti
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