A indução direta de hegemônicos endotélio e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição na pluripotentes humanas Células-Tronco

Summary

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

Abstract

Durante o desenvolvimento, as células hematopoiéticas surgem a partir de um subconjunto especializado de células endoteliais, endotélio hegemônicos (HE). Desenvolvimento de modelagem HE in vitro é essencial para estudos sobre os mecanismos da transição endotelial-hematopoiético e especificação hematopoiético. Aqui, nós descrevemos um método eficiente para a indução de HE partir de células humanas estaminais pluripotentes (hPSCs) por meio de sobre-expressão de diferentes conjuntos de factores de transcrição. A combinação de ETV2 e GATA1 ou GATA2 TF é utilizado para induzir HE com potencial pan-mielóide, enquanto uma combinação de factores de transcrição e GATA2 TAL1 permite a produção de HE com eritróide e potencial megacariocítica. A adição de LMO2 para GATA2 combinação e TAL1 acelera e aumenta substancialmente a diferenciação eritróide e células megacariocíticas produção. Este método proporciona um meio eficiente e rápida de indução HE de hPSCs e permite a observação do endotélio-hematopoietitransição C numa placa de cultura. O protocolo inclui procedimentos de transdução hPSCs e análise pós-transdução de HE e progenitores do sangue.

Introduction

A capacidade única de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para auto-renovar e diferenciar em células das três camadas germinativas, incluindo sangue, torná-los uma ferramenta valiosa para os estudos sobre os mecanismos de desenvolvimento hematopoiético, modelagem de doenças do sangue, despistagem de drogas, Os estudos de toxicidade, e ao desenvolvimento de terapias celulares. Porque a formação do sangue no embrião receitas provenientes endotélio hegemônicos (HE) por meio de uma transição endotelial hematopoiéticas ^1,2, a geração de HE em culturas seria essencial para estudar os mecanismos moleculares que regulam a endotelial a transição hematopoiético e especificação hematopoiético. Os métodos actuais para estudos de HE baseiam-se na indução de diferenciação hematoendothelial em agregados (EBS) com a adição de citocinas hematopoiéticas ^3-5, e de co-cultura com células estromais hPSCs hematopoiese ^6,7-suporte ou em culturas bidimensionais com extracelular matrizes e cytokines ^8,9. Estes métodos clássicos de diferenciação são baseadas na introdução de sinais externos que actuam na superfície da célula e iniciar a cascata de vias moleculares que conduzem eventualmente à activação transcricional de programa que controla o desenvolvimento hematoendothelial. Assim, a eficiência do hPSCs diferenciações nestes sistemas depende de uma indução eficaz desses sinais, a transdução de sinal para o núcleo, e a resultante activação da transcrição específicas de reguladores. Além disso, o estudo de HE em culturas de diferenciação convencionais requer o passo adicional de isolar as células HE utilizando separação de células. Aqui, descrevemos um protocolo simples para a indução direta de HE e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição hematopoiéticas. Este método permite a indução eficiente de HE em um prato e a observação directa da endotelial de transição hematopoiética sem a necessidade de isolamento de HE utilizando um procedimento de separação de células pesado.

Formação de HE e sangue a partir de células-tronco pluripotentes humanas podem ser eficientemente induzida pela superexpressão apenas alguns fatores de transcrição (TFS). A combinação ideal de TFs capazes de induzir robusto hematopoiese pan-mielóide de hPSCs inclui ETV2 e GATA1 ou GATA2. Em contraste, a combinação de GATA2 e TAL1 induz erythromegakaryocytopoiesis ^10. Programação hPSCs através da superexpressão desses fatores diferencia hPSCs diretamente para o VE-cad ⁺ CD43 ^– CD73 ^– HE células que gradualmente adquirir o fenótipo hematopoiéticas definido pela expressão do marcador CD43 cedo hematopoiéticas ^7. Este método baseia-lentiviral para a programação directa das células estaminais pluripotentes humanas método é aplicável para a geração de HE e células do sangue para os estudos mecanicistas, estudos de transição para endotelial e hematopoiética, a regulação da transcrição de desenvolvimento hematopoiético e especificação. Embora o Current protocolo descreve a produção de sangue usando a expressão constitutiva dos transgenes, resultados semelhantes podem ser obtidos utilizando modificado mRNA ^10.

Protocol

1. Preparações de vírus e fator de transcrição Combinações Prepare soluções com pSIN-EF1α lentiviral plasmídeo de expressão contendo ADN que codifica a proteína para ETV2, GATA1, GATA2, e TAL1 LMO2 (Tabela 1). Medir a concentração e a pureza das preparações de plasmídeos usados ​​para a produção de lentivírus gravação por absorção de UV com um espectrofotómetro a 230 nm, 260 nm e 280 nm. Nota: preparações de DNA demonstrando A260 / 280 e A260 /…

Representative Results

O diagrama esquemático de HE e indução de sangue hPSCs por sobre-expressão de factores de transcrição é apresentada na Figura 1. ETV2 combinação com GATA1 ou GATA2 induz a hematopoiese pan-mielóide, enquanto um GATA2, TAL1 +/- combinação LMO2 induz a hematopoiese predominantemente eritro-megacariocítica. Ambas as combinações TF diretamente induzida células o que, posteriormente, transformadas em células progenitoras de sangue com um espectro distinto de diferenciação …

Discussion

O método acima descrito para a diferenciação hematopoiética da hPSCs por sobre-expressão de TF, representa uma abordagem rápida e eficiente para a geração de HE e mielóides e erytho-magakaryocytic progenitores de hESCs e iPSCs, permitindo assim a produção de até 30 milhões de células de sangue de um milhão de células-tronco pluripotentes ^10. Este método exibiu diferenciação consistente em várias linhas de células estaminais embrionárias humanas e IPSCs ^10. Durante a diferencia…

Materials

Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.

pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61061	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61063	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61064	Lentiviral Vector
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Cationic polymer used to increase the efficiency of infection
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302	RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01	Cell Dissociation Reagent
Incomplete (growth factor- free) culture medium                                              mTeSR1 Custom formulation	WiCell Research Institute (Madison, WI)	MCF	Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb
human SCF	Peprotech	300-07	Premium grade
human TPO	Peprotech	300-18	Research grade
human FGF-basic	Peprotech	100-18B	Premium grade
CD144 (VE-cad) FITC	BD Biosciences	560411	Endothelial marker (FACS)
CD226 PE	BD Biosciences	338305	Hematopoietic (FACS)
CD43 PE	BD Biosciences	560199	Hematopoietic (FACS)
CD73 APC	R&D Systems	FAB5795A	Endothelial marker (FACS)
CD45 APC	BD Biosciences	555485	Hematopoietic (FACS)
7AAD	Life Technologies	A1310	Live/Dead assay (FACS)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Cell fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	Permeabilization
FBS	Fisher Scientific	SH3007003	Fetal bovine serum
Mouse anti-human CD43	BD Biosciences	551457	Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining
Rabbit anti-human VE-cadherin	BenderMedSystem	BMS158	Primary (IF)
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated	JacksonResearch	715-486-152	Secondary (IF)
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated	JacksonResearch	715-516-150	Secondary (IF)
DAPI nucleic acid stain	Life Technologies	D1306	Live/Dead assay (IF)
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	4435	CFC-assay
Wright Stain solution	Sigma -Aldrich	32857	Staining cytospins

Table 2. hPSCs culture.

Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)	WiCell Research Institute (Madison, WI)	hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells	hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers
Complete serum-free medium for culture of hPSCs                                                    mTeSR1 media	WiCell Research Institute (Madison, WI)	M500	Serum-free  medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs
Matrigel	BD Biosciences/ Corning	356234	Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs
DMEM/F-12, powder	Life Technologies	12500-062	Basal Medium
HyClone Dulbecco's PBS powder	Fisher Scientific	dSH30013.04	PBS
Dispase II, powder	Life Technologies	17105-041	Neutral protease, Cell dissociation

Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.

Primer's Name	Forward (Fwd)  5’ –>3’	Reverse (Rev) 5’–>3’	Discription
pSIN EF1a Fwd	TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA	—	EF1a promoter sequence
GATA1 Rev	—	TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC	Coding Region
GATA2 Rev	—	GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG	Coding Region
TAL1 Rev	—	AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT	Coding Region
LMO2 Rev	—	GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC	Coding Region
ETV2 Rev	—	GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC	Coding Region