Direkt Induktion av Hemogenic endotelet och Blood av Uttryck av transkriptionsfaktorer i Human pluripotenta stamceller

Summary

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

Abstract

Under utveckling, hematopoietiska celler härrör från en specialiserad delmängd av endotelceller, hemogenic endotel (HE). Modellering HE utveckling in vitro är avgörande för mekanistiska studier av endotel-hematopoetisk övergång och hematopoetisk specifikation. Här beskriver vi en metod för effektiv induktion av HE från humana pluripotenta stamceller (hPSCs) genom överuttryck av olika uppsättningar av transkriptionsfaktorer. Kombinationen av ETV2 och GATA1 eller GATA2 TF: används för att inducera HE med pan-myeloid potential, medan en kombination av GATA2 och TAL1 transkriptionsfaktorer medger framställning av HE med erytroida och megakaryocytisk potential. Tillsatsen av LMO2 till GATA2 och TAL1 kombination väsentligen accelererar differentiering och ökar erytroida och megakaryocytiska celler produktion. Denna metod ger ett effektivt och snabbt sätt att HE induktion från hPSCs och möjliggör observation av endotel-hematopoietic övergång i en odlingsskål. Protokollet inkluderar procedurer hPSCs överföring och efter transduktion analys av HE och blod stamceller.

Introduction

Den unika förmågan hos humana pluripotenta stamceller (hPSCs) att själv förnya och att differentiera till celler av de tre groddblad, inklusive blod, gör dem till ett värdefullt verktyg för mekanistiska studier av hematopoetiskt utveckling, modellering av blodsjukdomar, läkemedelsscreening, toxicitetsstudier, samt utveckling av cellulära terapier. Eftersom blodbildningen i embryot intäkterna från hemogenic endotel (HE) genom en endothelial hematopoetisk övergång ^1,2, skulle generering av HE i kulturer vara avgörande för att studera de molekylära mekanismer som reglerar endotel till hematopoetisk övergång och hematopoetisk specifikation. Aktuella metoder för studier av HE är baserade på induktion av hematoendothelial differentiering i aggregat (EBS) med tillägg av hematopoietiska cytokiner ^3-5, och samodling av hPSCs med Blodbildning-stödjande stromaceller ^6,7 eller i två-dimensionella odlingar med extracellulärt matriser och cytokines ^8,9. Dessa klassiska differentiering metoder är baserade på införandet av externa signaler som verkar på cellytan och initiera kaskader av molekylära vägar som så småningom leder till aktivering av transkriptions program vägledande hematoendothelial utveckling. Sålunda effektivitet hPSCs indelningar i dessa system förlitar sig på en effektiv induktion av dessa signaler, signaltransduktion till kärnan, och den resulterande aktivering av specifika transkriptionsregulatorer. Dessutom har studier av HE i konventionella differentieringsodlingar kräver det ytterligare steget att isolera HE celler med användning av cellsortering. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för direkt induktion av HE och blod genom överexpression av hematopoietiska transkriptionsfaktorer. Denna metod möjliggör effektiv induktion av HE i en skål och direkt observation av den endoteliala hematopoietiska övergång utan behov av isolering av HE med användning av en besvärlig cellsorteringsproceduren.

Bildning av HE och blod från humana pluripotenta stamceller kan effektivt induceras genom överuttryck bara några transkriptionsfaktorer (TFS). Den optimala kombinationen av TF kan inducera robusta pan-myeloid hematopoies från hPSCs inkluderar ETV2 och GATA1 eller GATA2. I motsats, en kombination av GATA2 och TAL1 inducerar erythromegakaryocytopoiesis ^10. Programmering hPSCs genom överuttryck av dessa faktorer skiljer hPSCs direkt till VE-cad ⁺ CD43 ^– CD73 ^– HE celler som gradvis förvärva hematopoetisk fenotyp definieras genom uttrycket av tidiga hematopoetiska markör CD43 ^7. Detta lentiviral-baserad metod för direkt programmering av mänskliga pluripotenta stamceller metod är tillämplig för generering av HE och blodceller för mekanistiska studier, studier av endotel hematopoietiska omvandlingar och transkriptionsreglering av hematopoetisk utveckling och specifikation. Även om cktuellt protokoll beskriver produktion blod med användning av konstitutiv expression av transgenerna, liknande resultat kan erhållas med användning av modifierat mRNA ^10.

Protocol

1. Virus Framställningar och transkriptionsfaktor Kombinationer Bered lösningar med PSIN-EF1a Lentiviral expressionsplasmid innehållande proteinkodande DNA för ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 och LMO2 (tabell 1). Mäta koncentrationen och renheten hos plasmid preparaten som används för Lentiviral produktion genom att registrera UV-absorption med en spektrofotometer vid 230 nm, 260 nm och 280 nm. Obs: DNA-preparat visar A260 / 280 och A260 / 230 värden större än 1,8 är allm…

Representative Results

Schemat i HE och blod induktion från hPSCs genom överuttryck av transkriptionsfaktorer visas i Figur 1. ETV2 med GATA1 eller GATA2 kombination inducerar pan-myeloid hematopoies, medan en GATA2, TAL1 +/- LMO2 kombination inducerar övervägande erytro-megakaryocytisk hematopoies. Båda TF kombinationer direkt inducerade HE celler som sedan omvandlas till blod stamceller med en distinkt spektrum av hematopoetisk differentiering. Differentieringen av hPSCs från pluripotent tillstånd till blod producera…

Discussion

Den ovan beskrivna metoden för hematopoetisk differentiering av hPSCs genom överuttryck av TF representerar en snabb och effektiv metod för generering av HE och myeloid och erytho-magakaryocytic stamceller från hESCs och iPSCs, varigenom produktion av upp till 30 miljoner blodkroppar från en miljon pluripotenta stamceller ^10. Denna metod uppvisade konsekvent differentiering i flera hESC och iPSCs ^linjerna 10. Under differentiering av ETV2 och GATA2, GATA1 faktorer samt GATA2 och TAL1 faktorer …

Materials

Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.

pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61061	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61063	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61064	Lentiviral Vector
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Cationic polymer used to increase the efficiency of infection
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302	RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01	Cell Dissociation Reagent
Incomplete (growth factor- free) culture medium                                              mTeSR1 Custom formulation	WiCell Research Institute (Madison, WI)	MCF	Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb
human SCF	Peprotech	300-07	Premium grade
human TPO	Peprotech	300-18	Research grade
human FGF-basic	Peprotech	100-18B	Premium grade
CD144 (VE-cad) FITC	BD Biosciences	560411	Endothelial marker (FACS)
CD226 PE	BD Biosciences	338305	Hematopoietic (FACS)
CD43 PE	BD Biosciences	560199	Hematopoietic (FACS)
CD73 APC	R&D Systems	FAB5795A	Endothelial marker (FACS)
CD45 APC	BD Biosciences	555485	Hematopoietic (FACS)
7AAD	Life Technologies	A1310	Live/Dead assay (FACS)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Cell fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	Permeabilization
FBS	Fisher Scientific	SH3007003	Fetal bovine serum
Mouse anti-human CD43	BD Biosciences	551457	Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining
Rabbit anti-human VE-cadherin	BenderMedSystem	BMS158	Primary (IF)
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated	JacksonResearch	715-486-152	Secondary (IF)
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated	JacksonResearch	715-516-150	Secondary (IF)
DAPI nucleic acid stain	Life Technologies	D1306	Live/Dead assay (IF)
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	4435	CFC-assay
Wright Stain solution	Sigma -Aldrich	32857	Staining cytospins

Table 2. hPSCs culture.

Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)	WiCell Research Institute (Madison, WI)	hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells	hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers
Complete serum-free medium for culture of hPSCs                                                    mTeSR1 media	WiCell Research Institute (Madison, WI)	M500	Serum-free  medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs
Matrigel	BD Biosciences/ Corning	356234	Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs
DMEM/F-12, powder	Life Technologies	12500-062	Basal Medium
HyClone Dulbecco's PBS powder	Fisher Scientific	dSH30013.04	PBS
Dispase II, powder	Life Technologies	17105-041	Neutral protease, Cell dissociation

Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.

Primer's Name	Forward (Fwd)  5’ –>3’	Reverse (Rev) 5’–>3’	Discription
pSIN EF1a Fwd	TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA	—	EF1a promoter sequence
GATA1 Rev	—	TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC	Coding Region
GATA2 Rev	—	GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG	Coding Region
TAL1 Rev	—	AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT	Coding Region
LMO2 Rev	—	GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC	Coding Region
ETV2 Rev	—	GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC	Coding Region