स्तनधारी कोशिकाओं में मानव Granzymes की एक उच्च उपज और लागत प्रभावी अभिव्यक्ति प्रणाली
Summary
We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.
Abstract
When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.
Introduction
Gzms विशेष सीटीएल की लाइसोसोम और एन.के. कोशिकाओं 1 में स्थानीय अत्यधिक मुताबिक़ सेरीन प्रोटिएजों के एक परिवार के हैं। इन हत्यारा कोशिकाओं की साइटोटोक्सिक कणिकाओं भी उन्मूलन 2,3 के लिए किस्मत में एक लक्ष्य सेल की मान्यता पर Gzms के साथ एक साथ जारी कर रहे हैं कि झिल्ली में खलल न डालें प्रोटीन PFN और GNLY होते हैं। (- जी, कश्मीर, और एम एन GzmA) मानव (GzmA, बी, एच, कश्मीर और एम) में पांच Gzms, और चूहों में 10 Gzms कर रहे हैं। GzmA और GzmB सबसे प्रचुर मात्रा में है और बड़े पैमाने पर इंसानों और चूहों 1 में अध्ययन कर रहे हैं। हालाँकि, और अधिक हाल ही के अध्ययन सेल मौत रास्ते के रूप में अच्छी तरह से स्वास्थ्य और रोग 4 में अन्य तथाकथित अनाथ Gzms द्वारा मध्यस्थता अतिरिक्त जैविक प्रभाव की जांच करने के लिए शुरू कर दिया है।
PFN 5,6 द्वारा लक्ष्य कोशिकाओं में कर दिया जब Gzms का सबसे अच्छा ज्ञात समारोह, GzmA और GzmB की विशेष रूप से, स्तनधारी कोशिकाओं में क्रमादेशित कोशिका मृत्यु के शामिल है। लेकिन, और अधिक हाल के अध्ययनों से यह भी PFN 7,8 द्वारा स्वतंत्र रूप से साइटोसोलिक प्रसव की, प्रतिरक्षा विनियमन और सूजन पर गहरा प्रभाव के साथ Gzms के बाह्य प्रभावों का प्रदर्शन किया। Gzms के साइटोसोलिक प्रवेश के बाद कुशलता से मारे गए हैं कि कोशिकाओं के स्पेक्ट्रम भी हाल ही में बैक्टीरिया 9,10 और यहां तक कि कुछ परजीवी से 11 स्तनधारी कोशिकाओं से चौड़ी हो गई थी। ये हाल की खोजों Gzm शोधकर्ताओं के लिए एक नया क्षेत्र खोल दिया। इसलिए, एक लागत प्रभावी, उच्च उपज स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली काफी उन भविष्य के अध्ययन के लिए रास्ता आसान हो जाएगा।
मूल निवासी मानव, माउस और चूहे Gzms सफलतापूर्वक सीटीएल और एन.के. कोशिकाओं लाइनों 12-14 का दाना अंश से शुद्ध किया गया है। हालांकि, हमारे हाथ में इस तरह के शोधन तकनीक की उपज कम से कम 0.1 मिलीग्राम / एल सेल संस्कृति (अप्रकाशित अवलोकन और 12) की सीमा में है। इसके अलावा, othe के द्वारा संक्रमण के बिना एक भी Gzm की chromatographic संकल्पआर Gzms और / या कणिकाओं में भी मौजूद हैं कि प्रोटीन (अप्रकाशित डेटा और 12,14) चुनौती दे रहा है। संयोजक Gzms भी इस तरह के HEK 293 18,19 के रूप में स्तनधारी कोशिकाओं में बैक्टीरिया 15, खमीर 16, कीट कोशिकाओं 17 में और में तैयार किए गए। केवल स्तनधारी अभिव्यक्ति सिस्टम देशी साइटोटोक्सिक प्रोटीन के समान posttranslational संशोधनों के साथ पुनः संयोजक एंजाइमों का उत्पादन करने की क्षमता सहन। Posttranslational संशोधनों endocytosis के द्वारा विशिष्ट तेज और लक्ष्य कोशिकाओं 20-22 भीतर प्रोटीज के intracellular स्थानीयकरण के साथ फंसाया गया है। इसलिए, pHLsec 23 का उपयोग करके Gzm अभिव्यक्ति के लिए प्लाज्मिड रीढ़ के रूप में (राडू Aricescu और वोन जोन्स, ऑक्सफोर्ड, ब्रिटेन के विश्वविद्यालय के एक तरह का उपहार), हम में उच्च उपज प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक सरल, समय और लागत प्रभावी प्रणाली की स्थापना HEK293T कोशिकाओं। pHLsec एक चिकन Β actin के प्रमोटर के साथ एक सीएमवी बढ़ाने को जोड़ती है; साथ में, इन तत्वों प्रदर्शन हैटेड विभिन्न सेल लाइनों 24 में सबसे मजबूत प्रमोटर गतिविधि। इसके अलावा, प्लाज्मिड एक खरगोश Β ग्लोबिन Intron, अनुकूलित कोज़ाक और स्राव का संकेत है, एक लिस-6xHis-टैग और एक पाली-एक संकेत होता है। इंसर्ट के स्राव संकेत और उपयुक्त एन टर्मिनल डोमेन के कमी प्रोटीन के लिए इष्टतम अभिव्यक्ति और स्राव दक्षता सुनिश्चित करने लिस-6xHis-टैग (चित्रा 1) के बीच आसानी से क्लोन किया जा सकता है। Gzms की अभिव्यक्ति के लिए, हम इतना है कि ई.के. उपचार स्रावित Gzms (सक्रिय Gzms एन टर्मिनल के साथ शुरू सक्रिय एक enterokinase (ई.के.) साइट (DDDDK) द्वारा पीछा वेक्टर द्वारा प्रदान की गई स्राव संकेत के साथ अंतर्जात स्राव संकेत अनुक्रम की जगह अमीनो एसिड अनुक्रम IIGG 25)। इसके साथ ही इस विधि के लिए पक्ष में, HEK293T कोशिकाओं ऐसे Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के रूप में, कम कीमत माध्यम में तेजी से बढ़ती है, और लागत प्रभावी कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक विधि के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
GzmA और GzmB के शास्त्रीय और बड़े पैमाने पर अध्ययन भूमिका ताकना के गठन प्रोटीन PFN 1 से उनके साइटोसोलिक प्रसव के बाद स्तनधारी कोशिकाओं में apoptosis के शामिल है। हाल ही में, Gzms की साइटोटोक्सिक स्पेक्ट्रम बैक्टीर?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Novartis Foundation for Medical-Biological Research and from the Research Pool of the University of Fribourg (to MW). We thank Li Zhao, Zhan Xu, and Solange Kharoubi Hess for technical support, as well as Radu Aricescu and Yvonne Jones (Oxford University, UK) for providing the pHLsec plasmid, and Thomas Schürpf (Harvard Medical School) for helpful discussions.
Materials
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
| HisTrap Excel 5ml-column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
| HiTrap SP HP 5 ml-column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
| N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
| Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
| 5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |
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