We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.
When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.
De Gzms är en familj av mycket homologa serinproteaser lokaliserade i specialiserade lysosomer av CTL och NK-celler 1. De cytotoxiska granuler av dessa mördarceller innehåller också membranstörande proteiner PFN och GNLY som publiceras samtidigt med Gzms vid erkännandet av en målcell avsedd för eliminering 2,3. Det finns fem Gzms hos människor (GzmA, B, H, K och M), och 10 Gzms i möss (GzmA – G, K, M och N). GzmA och GzmB är de mest förekommande och omfattande i människor och möss 1. Emellertid har nyare studier börjat undersöka celldöds vägar samt ytterligare biologiska effekter som förmedlas av de andra, så kallade föräldralösa Gzms i hälsa och sjukdom 4.
Den mest kända funktionen av Gzms, speciellt av GzmA och GzmB, är induktionen av programmerad celldöd i däggdjursceller vid leverans i målcellema genom PFN 5,6. Emellertid, Senare studier visade också extracellulära effekterna av Gzms med stor inverkan på immunreglering och inflammation, oberoende av cytosoliskt leverans av PFN 7,8. Spektrumet av celler som dödas effektivt efter cytosoliskt inträde av Gzms har också nyligen utvidgats från däggdjursceller till bakterier 9,10 och även vissa parasiter 11. Dessa senaste upptäckterna öppnat en helt nytt område för GZM forskare. Därför kommer en kostnadseffektiv, hög avkastning mammalieexpressionssystem avsevärt underlätta för dessa framtida studier.
Native människa, mus och råtta Gzms har framgångsrikt renas från granulat fraktion av CTL och NK-celler linjer 12-14. Emellertid, i våra händer var utbytet av sådana reningstekniker är i området av mindre än 0,1 mg / I cellodling (opublicerad observation och 12). Vidare, den kromatografiska upplösningen av en enda GZM utan förorening med andrasr Gzms och / eller proteiner som också finns i granulerna är utmanande (opublicerade data och 12,14). Rekombinanta Gzms producerades i bakterier 15, jäst 16, insektsceller 17 och även i däggdjursceller såsom HEK 293 18,19. Endast de däggdjursexpressionssystem bära potential att producera rekombinanta enzymerna med posttranslationella modifieringar som är identiska med den naturliga cytotoxiska protein. Posttranslationella modifieringar har varit inblandade med den specifikt upptag genom endocytos och den intracellulära lokaliseringen av proteaset inom målceller 20-22. Därför genom att använda pHLsec 23 (en slags gåva av Radu Aricescu och Yvonne Jones, University of Oxford, Storbritannien) som plasmidskelettet för GZM uttryck, har vi etablerat en enkel, tids- och kostnadseffektivt system för högavkastande proteinproduktion i HEK293T celler. pHLsec kombinerar en CMV-förstärkare med en kyckling Β-aktinpromotor; Sammantaget ger dessa faktorer demonstrationsTed den starkaste promotoraktivitet i olika cellinjer 24. Dessutom innehåller plasmiden en kanin Β-globin intron, optimerade Kozak och sekretionssignaler, en Lys-6xHis-tagg och en poly-A-signal. Skär kan klonas bekvämt mellan utsöndringssignalen och Lys-6xHis-tag (figur 1) säkerställa optimal expression och sekre effektivitet för proteiner som saknar lämpliga N-terminala domänerna. För expression av de Gzms ersatte vi den endogena utsöndringssignalsekvens med utsöndringssignalen som tillhandahålls av vektorn följt av ett enterokinas (EK) plats (DDDDK) så att EK behandling aktiverade de utsöndrade Gzms (aktiva Gzms börjar med den N-terminala aminosyrasekvensen IIGG 25). Dessutom till fördel för denna metod, HEK293T celler växer snabbt i lågpris medium, såsom Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), och är väl lämpade för kostnadseffektiv kalciumfosfat-transfektion metoden.
Den klassiska och omfattande studerat rollen för GzmA och GzmB är induktionen av apoptos i däggdjursceller efter deras cytosoliska leverans av det porbildande protein PFN 1. Nyligen var den cytotoxiska spektrum av Gzms breddats avsevärt från däggdjursceller till bakterier 9,10, liksom till vissa parasiter 11. Vidare är de icke-klassisk, extracellulära funktioner i GzmA och GzmB liksom den biologiska betydelsen av de olika anonyma Gzms är fortfarande oklar. Därför är en robust…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Novartis Foundation for Medical-Biological Research and from the Research Pool of the University of Fribourg (to MW). We thank Li Zhao, Zhan Xu, and Solange Kharoubi Hess for technical support, as well as Radu Aricescu and Yvonne Jones (Oxford University, UK) for providing the pHLsec plasmid, and Thomas Schürpf (Harvard Medical School) for helpful discussions.
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
HisTrap Excel 5ml-column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
HiTrap SP HP 5 ml-column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |