Att mäta DNA-skador och reparation i mussplenocyter Efter kronisk<em> In Vivo</em> Exponering för mycket låga doser av beta- och gamma-strålning
Summary
A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.
Abstract
Strålning Låg dos kan producera en mängd biologiska effekter som skiljer sig i kvantitet och kvalitet från de effekter som höga stråldoser. Att ta itu med frågor som rör miljö, arbetsmiljö och folkhälsa säkerhet på ett korrekt och vetenskapligt motiverat sätt är starkt beroende av förmågan att noggrant mäta de biologiska effekterna av låga doser föroreningar, såsom joniserande strålning och kemiska ämnen. DNA-skador och reparation är de viktigaste tidiga indikatorer på hälsorisker på grund av deras potentiella konsekvenser på lång sikt, såsom cancer. Här beskriver vi ett protokoll för att studera effekten av kronisk in vivo exponering för låga doser av γ- och β-strålning på DNA-skador och reparation i musmjältceller. Med hjälp av en allmänt accepterad markör för DNA dubbel-strängbrott, fosforylerad histon H2AX kallas γH2AX visar vi hur det kan användas för att utvärdera inte bara nivåerna av DNA-skada, men även förändringari DNA-reparation kapacitet potentiellt produceras av låg dos in vivo exponeringar. Flödescytometri möjliggör snabb, korrekt och tillförlitlig mätning av immunofluorescently märkt γH2AX i ett stort antal prover. DNA dubbelsträngbrott reparation kan utvärderas genom att exponera extraherade splenocyter till en utmanande dos av 2 Gy för att producera ett tillräckligt antal DNA-brott för att utlösa reparation och genom att mäta den inducerade (1 h efter bestrålning) och kvarvarande DNA-skada (24 tim efter bestrålning). Återstående DNA-skada skulle vara ett tecken på ofullständig reparation och risken för långsiktiga genomisk instabilitet och cancer. I kombination med andra analyser och slutpunkter som lätt kan mätas på ett sådant in vivo-studier (t.ex., kromosomavvikelser, mikrokärnor frekvenser i benmärg retikulocyter, genuttryck, etc.), kan detta tillvägagångssätt en noggrann och kontextuell utvärdering av de biologiska effekterna med låg nivå stress.
Introduction
Betydande kontroverser över de potentiella skadliga effekterna av antingen låga eller mycket låga doser av joniserande strålning och allmänhetens rädsla för strålning, som drivs av bilder av Hiroshima och Nagasaki atombombningar och av sällsynta kärnkraftverk olyckor (förvärras av massmedia), har lett till mycket strikt strålskydd reglering och standarder som är potentiellt inte är vetenskapligt motiverat. Under de senaste tre decennierna har ett stort antal rapporter dokumenterat både bristen på skadliga och förekomsten av potentiellt fördelaktiga biologiska effekter induceras av låg stråldos 1-4. Den största risken strålningshälsofaktor är sannolikheten för cancer, uppskattas baserat på epidemiologiska studier av atombomben överlevande får höga eller medel stråldoser. Linjär extrapolering av dessa data (sk linjär-no-tröskel eller LNT modell) används för att beräkna risken för cancer vid låga doser. Dock har denna metod inte fått världsomfattande vetenskaplig acceptansoch är starkt debatt 5.
Det är uppenbart att fler studier behövs för att klargöra denna fråga och eventuellt förbättra normer för strålskydd. Sådana studier bör omfatta kroniska behandlingar (bästa tillnärmning av miljö- och yrkesmässig exponering), in vivo djurmodeller (bäst för att extrapolera effekter på människors) och sådana slutpunkter som DNA skada priser, DNA-reparation och mutagenes. Det är känt att DNA är det primära målet för skada strålningseffekter och ofullständig eller felaktig reparation kan leda till mutagenes och cancerutveckling 6.
DNA dubbel-strängbrott (DSB) är en av de mest skadliga typer av DNA-lesioner och kan leda till celldöd och tumorigenes 7. Det är därför viktigt att kunna pålitligt och noggrant mäta graden av DSB efter exponering för låga stråldosen och / eller andra stressfaktorer, såsom kemiska föroreningar. En av de mest känsliga och specifika markörerDNA DSB fosforyleras histon H2AX, kallas γH2AX 8, men andra markörer och metoder har föreslagits 9,10. Det beräknas att tusentals H2AX molekyler, i närheten av en inducerad DSB, är involverade i bildandet av γH2AX möjliggör detektion av enskilda DSB genom immunofluorescens märkning med en anti-γH2AX antikropp och fluorescensmikroskopi 11. Responsen är mycket snabb och nådde sitt maximum mellan 30 och 60 minuter. Det finns belägg för att γH2AX underlättar reparation av DNA DSB genom att locka andra reparations faktorer till platserna för raster och genom att modifiera kromatinstruktur att förankra brutna DNA ändar och ge tillträde för andra reparationsproteiner (granskas i 12). Efter avslutad reparation av DNA DSB, blir γH2AX de-fosforylerad och / eller genomgår nedbrytning, och nysyntetiserade H2AX molekyler ersätter γH2AX i de drabbade områdena i kromatin 10. Monitorering och förlust av γH2AX kan,Därför ger en korrekt uppskattning av DNA DSB reparation kinetik. Denna metod har använts för att studera reparation av DSB i olika humana tumörcellinjer bestrålas med höga doser av strålning och dess hastighet och rest DSB nivåer har visat sig korrelera med strålkänslighet 13-15.
Vi ändrade detta experimentella tillvägagångssätt och tillämpat den på en in vivo-studie musen för att undersöka effekterna av låga doser av kronisk γ- och β-strålning på DNA DSB nivåer och reparation (Figur 1). För det första visar vi en metod för att göra en långsiktig kronisk exponering av möss för att β-strålning antingen utsänds av tritium (väte-3) i form av tritierat vatten (HTO) eller som organiskt bundet tritium (OBT) upplöst i dricksvatten . De två formerna förväntas ackumuleras och / eller distribuera olika i kroppen och därför producerar olika biologiska effekter. Båda formerna är potentiella faror i kärnkraftsindustrin. Denna behandlingär parallellt med kronisk exponering för γ-strålning vid en ekvivalent dos hastighet för att tillåta en korrekt jämförelse av de två typerna strålnings, vilket är avgörande för utvärdering av deras relativa biologiska effektiviteten. Beta-strålning består av elektroner, vilket gör det mycket olikt från γ-strålning, hög energi fotoner. På grund av denna skillnad, representerar Β-strålning mestadels inre hälsorisk och kan ge olika biologiska effekter jämfört med γ-strålning. Denna komplikation lett till betydande kontroverser över regleringen av exponering för β-strålning från HTO. Således, regulatoriska nivåer av HTO i dricksvatten för allmänheten varierar från 100 Bq / L i Europa till 75.000 Bq / L i Australien. Det är därför viktigt att jämföra biologiska effekterna av HTO för likvärdiga doser av γ-strålning. För det andra är graden av DNA DSB mätt i isolerade splenocyter vid slutförandet av kronisk exponering använder immunofluorescently märkt γH2AX upptäckaed med flödescytometri. Detta möjliggör utvärdering av omfattningen av DNA-skador som orsakats av de in vivo-exponering. Det är emellertid förnuftigt att förvänta sig att sådan låg nivå exponeringar inte kan ge några detekterbara hastigheter av DNA-DSB; istället, vissa dolda förändringar / svar kan förväntas att detta skulle påverka cellernas förmåga att reparera DNA-skada. Dessa förändringar, om den påträffas, kan antingen vara stimulerande (som producerar en gynnsam effekt) eller hämmande (som producerar en skadlig effekt). Den föreslagna protokollet tillåter avslöjar sådana förändringar genom att utmana de extraherade splenocyterna med en hög dos av strålning som ger en betydande mängd skador (t.ex. 2 Gy producerar cirka 50 DNA DSB per cell eller en 3 -. 5-faldig ökning av den totala γH2AX nivå) . Därefter, bildandet och förlust av γH2AX, vilket återspeglar den initiering och slutförande av DSB-reparation, övervakas genom flödescytometri. På detta sätt kan inte bara basal och behandlings inducerade nivåer av DNA-DSB mätas, menäven dess potentiella inverkan på cellernas förmåga att reagera och reparera DNA-skador som induceras av mycket högre stressnivåer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet presenteras i detta dokument är användbar för att genomföra storskaliga mus in vivo-studier som undersöker de genotoxiska effekterna av låga halter av olika kemiska och fysikaliska medel, inklusive joniserande strålning. Vår unika specifika patogen-fria djur anläggning som är utrustad med en GammaBeam 150 bestrå och en 30 meter lång bestrålning hall kan genomföra livslånga studier med låga eller mycket låga doser ränta irradiations på hundratals eller tusentals möss. Mindre bestr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).
Materials
| HTO: tritiated water, [3H] | locally obtained from a nuclear reactor | stock activity 3.7 GBq/mL; can be substituted with HTO from Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| tritiated water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substitute for HTO of local origin |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | locally manufactured | can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity |
| tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody | Life Technologies (formerly Invitrogen) | A21121 | |
| propidium iodine | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1mg/mL |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500ml bottles Absolute Ethanol |
| 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifuge tubes |
| 15 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile polypropylene centrifuge tubes |
| liquid nitrogen | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm mL uncapped glass tubes | Fisher Scientific | K60B1496126 | disposable borosilicate glass tubes with plain end |
| T25 flasks | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340) |
| scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner scissors 12cm sharp/sharp |
| forceps, straight | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken forceps 13cm, straight |
| forceps, curved | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern forceps 12 cm, curved |
| 60 mm petri dishes | VWR | CA25382-100 | BD Falcon tissue culture dish 60x15mm |
| cell strainers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon cell strainers 50/case |
| PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200mL of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphate Buffered Saline Tablets |
| TBS recipe: to make 10X Stock, | |||
| 30g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Sodium Chloride |
| 2g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Potassium Chloride |
| Dissolve in 1L of deionized water, adjust pH to 7.4 |
Riferimenti
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
- Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
- Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
- Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
- Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
- Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
- Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
- Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
- Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
- Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
- Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
- Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
- Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
- Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
- Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
- Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).
