Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.
Afgrænsning af en celles ultrastruktur er vigtigt for at forstå dens funktion. Dette kan være en skræmmende projekt for sjældne celletyper diffunderede gennem væv fremstillet af forskellige celletyper, såsom enteroendocrine celler af det intestinale epitel. Disse gastrointestinale sensorer af mad og bakterier har været vanskeligt at studere, fordi de er spredt blandt andre epitelceller i et forhold på 1: 1.000. For nylig er transgene reporter mus blevet genereret til at identificere enteroendocrine celler ved hjælp af fluorescens. Et af disse er det peptid YY-GFP mus. Brug af denne mus, vi udviklet en metode til at korrelere konfokal og seriebloknummer-face scanning elektronmikroskopi. Vi kaldte metoden cocem3D og anvendt den til at identificere en bestemt enteroendokrine celle i væv og afsløre cellens ultrastruktur i 3D. Opløsningen på cocem3D er tilstrækkelig til at identificere organeller så lille som sekretoriske vesikler og til at skelne cellemembraner for volumen rendering. Cocem3D kan let tilpasses til at studere 3D ultrastruktur andre specifikke celletyper i deres native væv.
Livet inde i en celle foregår i tid og rum. Ændringer over tid er ofte studeres ved hjælp af time-lapse mikroskopi kombineret med fluorescens imaging teknikker, ligesom super opløsning mikroskopi. Plads, især arrangementet af organeller inde i en celle eller celle-til-celle-interaktioner, kan kun udledes ved en fuldstændig redegørelse for cellens fine struktur. En omfattende hensyn til en celles fin struktur kan også bringe klarhed til genomisk funktion i tilfælde, hvor genomet er tilgængelig, ligesom C. elegans nematode 1 eller den flade placozoa tricoplax adherens 2. Seriel sektionering elektronmikroskopi er nu en reproducerbar, tid effektiv og mindre bekostelig opgave takket være udviklingen af automatiserede 3D elektron mikroskopi teknologier, som seriebloknummer-face scanning elektronmikroskopi 3 (SBEM).
Behovet for strukturel information til at belyse funktionen er meget tydeligt i visse cell typer hvor funktion afhænger af fysiske celle-til-celle-interaktioner, såsom neuroner, glia eller sensoriske epithelceller. Vi er især interesserede i at belyse, hvorledes sensoriske signaler fra næringsstoffer i lumen af tarmen transduceres til et elektrisk signal, der i sidste ende modulerer appetitforstyrrelser adfærd. Kredsløbet er kompliceret, men begynder ved væggen af tarmen, hvor næringsstoffer kommer i kontakt med sensoriske epithelceller, kaldet enteroendocrine celler. I modsætning til andre sensoriske epithelceller, såsom smag celler, enteroendocrine celler spredt i hele tarmen epitel i et forhold på 1 til 1000 4-7. Derfor har de været vanskeligt at identificere og studere, og i lang tid, de blev betragtet kun som en kilde til gut hormoner. Men med udviklingen af celle-specifik fluorescens reporter mus, er den komplekse sensoriske funktion af disse celler opstå. Ved hjælp af en af disse reporter mus, et peptid YY-GFP (PyyGFP) mus, fandt vi, at enteroendocrIne celler har en fremtrædende cytoplasmatiske hale, som vi navngivet neuropod. Fremkomsten af neuropods foreslog et konserveret funktion i celle-til-celle kommunikation. Således har vi ræsonnerede, at ved at dokumentere ultrastruktur en enteroendokrin celle, kunne funktionen af neuropods afledes.
Behovet for at forstå strukturen af et vedhæng på en spredt celle, som er vanskeligt at identificere var den vigtigste rationale for at udvikle en metode til at kombinere konfokal mikroskopi og SBEM. Cellen af interesse blev identificeret ved anvendelse PyyGFP enteroendokrine cellespecifikke reporter mus. Metoden gav os mulighed for at dokumentere hele ultrastruktur en enteroendokrine celle og dens neuropod. Inden neuropods fandt vi strukturelle træk af neuronale axoner, og uden neuropods, fandt vi en fysisk forhold til enterisk glia 8. Faktisk neuropods indeholder ca. 70% af alle sekretoriske vesikler tyder på en væsentlig rolle i den sekretoriske funktion af disse celler. Med udgangspunkt i denstrukturelle data, mere for nylig fandt vi, at gennem disse neuropods, enteroendocrine celler og neuroner innerverer tarmen danner en neuroepitel kredsløb, svarende til den i smag celler i tungen 8,9.
Afdækning af sådanne funktioner i gastrointestinale chemosensory mekanismer stammede fra strukturelle data indsamlet ved hjælp af denne korrelative mikroskopi metode. Vi mener, at denne metode kan være nyttig på andre områder af cellebiologi, navnlig når cellerne er dispergeret inden vævene på et meget lavt forhold. Vi henviser til de metoder som korrelative konfokal og seriebloknummer face scanning elektronmikroskopi i 3D (Cocem3D). Metoden består af følgende hovedtrin: væv dissektion, konfokal mikroskopi, SBEM billedbehandling, SBEM og konfokal billede korrelation, og manuel segmentering. Sammenlignet med andre korrelative metoder, konceptet er ret simpelt, fordi sammenhængen er fysiske snarere end kemiske.
Gastrointestinal chemosensation fremstår som et spændende nyt område inden for biomedicinsk forskning. Dette er i stor del på grund af opdagelsen af funktionelle smagsreceptorer i enteroendocrine celler 18. Efterfølgende undersøgelser har vist, at enteroendocrine celler udtrykker specifikke receptorer for næringsstoffer, herunder kulhydrater, lipider og aminosyrer 5,6,19,20. Den katalytiske faktor for disse opdagelser har været udviklingen af reporter mus, hvori enteroendocrine celler er fluorescensmærket 20. Vi udviklede en af disse mus, den PyyGFP mus, at studere enteroendocrine celler af den distale tyndtarm og tyktarm 17,21. Disse celler er af interesse, fordi de udskiller PYY og glucagon-lignende peptid 1, som begge er inducere af mæthed 22,23. På det tidspunkt en fuldstændig ultra-strukturel hensyn til disse celler manglede, som vi mente var vigtigt at forstå deres signaling mekanismer.
Indholdsproduktion "> Her beskrev vi en visuelt en metode til at bygge bro konfokal mikroskopi med SBEM. Fremgangsmåden er nævnt som Cocem3D, hvilket tillod os at dokumentere den komplette ultrastruktur enteroendocrine celler. Vi har rapporteret, at disse celler har en neuropod der indeholder tre fjerdedele af alle de sekretoriske vesikler 8. Inden for neuropod, der neurofilamenter og meget gerne neuronale axoner er neuropods næres af enteriske gliaceller 8. Vigtigere er det dog disse neuropods der enteroendokrine celler forbinde fysisk til neuroner innerverer tarmen og colon 9.En af styrkerne ved cocem3D er dets enkelhed. Reduktion af vævsprøven i en blok, der kan afbildes ved konfokal og SBEM letter identifikation af en specifik celle i et væv. Sekretoriske vesikler og andre organeller kan identificeres med lethed ved en opløsning på 7 nm / pixel. Fordi afsnittene i SBEM bortskaffes, yderligere processynge af væv til at identificere specifikke proteiner er ikke en mulighed på dette tidspunkt. Men udvikling af metoder såsom ATUM 24, i hvilke afsnit fra vævsblokken bevares, vil sandsynligvis muliggøre identifikation af specifikke proteiner i cellen,. Bestemmelse af specifikke placering af chemosensory receptorer på enteroendocrine celler er vigtig information for udviklingen af lægemiddelterapier for fedme, fordi enteroendocrine celler er en sensorisk grænseflade mellem fødevarer i tarmen og mæthed i hjernen.
The authors have nothing to disclose.
Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Bohórquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.
Phosphate buffered saline | Life technologies | 10010023 | |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4%, freshly made in PBS, final pH 7.4 |
Glutaraldehyde | Sigma | G5882 | |
Dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
Low-melting agarose | Life technologies | 16520-100 | 5%, freshly made in PBS |
Standard Tissue-Tek Cryomold | Electron Microscopy Sciences | 62534-25 | |
DAPI nuclear stain | Life technologies | D1306 | |
Postively charged glass slides and coverslips | |||
Fine art paintbrush #1 | |||
Cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 11650 | |
Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21700 | |
EMbed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
Liquid releasing agent | Electron Microscopy Sciences | 70880 | |
Liquid silver colloidal | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
CircuitWorks conductive epoxy | ITW Chemtronics | CW2400 | |
Variable flow peristaltic pump | VWR | 70730-064 | |
VT1200S Vibrating blade microtome | Leica | ||
Zeiss 780i confocal microscope | Carl Zeiss | ||
Sigma VP Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss | ||
3view system | Gatan | ||
Renovo Neural Inc (Cleveland, OH) | http://www.renovoneural.com | Renovo provides 3d EM services | |
Fiji software | Open access software | ||
Computer station with 16GB of RAM or more | |||
Data visualization software Imaris 7.5 | Bitplane |