Kvantifisering av endotelcelle klebrighet<em> In Vitro</em

Summary

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Abstract

En av kardinal prosesser av betennelse er infiltrasjon av immunceller fra hulrommet i blodkaret til det omgivende vev. Dette skjer når endotelceller, hvilken linje blodkar, blir limet til sirkulerende immunceller slik som monocytter. In vitro måling av denne klebeevne har frem til nå blitt gjort ved å kvantifisere det totale antall monocytter som fester seg til en endotelial sjiktet enten som en direkte telling eller ved indirekte måling av fluorescensen av adherente monocytter. Selv om slike målinger, indikerer at den gjennomsnittlige klebrighet endotelial cellepopulasjon, er de skamme av en rekke faktorer, så som celleantall, og avslører ikke andelen av endotelceller som faktisk er limet. Her beskriver vi og vise en metode som gjør det mulig opptellingen av selvklebende celler i en testet befolkning på endothelial enkeltlag. Endoteliale celler blir dyrket på dekkglass, og følgende ønskedebehandling blir utfordret med monocytter (som kan være fluorescensmerket). Etter inkubasjon en skylling prosedyre som involverer flere runder med nedsenking og drenering, blir cellene fiksert. Selvklebende endotelceller, som er omgitt av monocytter blir lett identifiseres og nummerert, noe som gir en adhesjon indeks som viser den faktiske andel av endoteliale celler i populasjonen som er limet.

Introduction

Infiltrasjon av immunceller som monocytter over endotelceller lag som linje blodkar er et viktig skritt i prosessen med betennelse ^1. Dette gjør at homing av immunceller (immunocytter) til et skadested. I andre tilfeller og steder som kransarterien og halspulsåren, kan infiltrering av monocytter gjennom endoteliale sjikt føre til uønsket lang sikt oppholdstid av disse cellene i veggen av arterien, som kan føre til dannelsen av plakk ^2. I alle tilfeller av immunocytt infiltrering, innebærer det første trinnet aktivering av endotelcellene i et lokalisert område i blodkaret. Endotelceller aktiveres av pro-inflammatoriske cytokiner som TNF-α og IL-6 for å øke ekspresjonen av celleoverflateproteiner som for eksempel VCAM, ICAM og E-selektin som letter rekruttering og feste av immunocytter på endotelcelleoverflaten, hvorved ^{3- 6.}

<p class = "jove_content"> å begynne med måling av endotelial celleadhesjon ble utført ved telling av monocytter som klebet til endotele monolag ^7. Begrensningene ved denne metoden når det gjelder presisjon ført til bruk av radiomerket lymfocytt eller monocytt, etterfulgt av kvantifisering av radioaktivt materiale som tilsvarer lymfocytter eller monocytter adhesjon ^4. Denne metoden ble etter hvert erstattet av en fluorescens-basert metode, hvorved immunocytter av interesse ble merket med fluorescens fargestoff og utsatt for den samme prosedyren som ovenfor med den forskjell at i stedet for fluorescens radioaktiviteten måles ^8. Tiden denne metoden har dukket opp som den mest praktiske og selges som byggesett av flere kommersielle leverandører. Selv om denne assay kan måle relative nivåer av klebrig mellom kontroller og eksperimentelle eksempler, vil det ikke avsløre om en endring i fluorescens er på grunn av en jevn endring i klebeevnen på tvers av hele endothelial cellepopulasjon, eller hvis endringen skyldes en forskjell på klebrighet i løpet av en sub-populasjon av celler. Det er også tydelig at stringens vaske utøver en dyp effekt på resultatet, og enda viktigere, vil enhetlig skylling av ubundne monocytter mellom ulike endothelial cellemonolag påvirke sterkt på nærhet av resultater fra replikater og reproduserbarhet av resultatene mellom prøvene . Mer nylig ble flere systemer som pumper monocytter i media over en endotelial celle monolag brukt for å løse dette problemet ^9. I tillegg er disse strømningssystemer også rekapitulere virkningen av skjærkraft på endotelceller. Mens fordelene ved slike systemer er klar og meget tiltalende, er det også viktig å innse at selv kan endotelcelle klebrighet bli sterkt utvidet, slik tilfellet er i akutt inflammasjon, av faktorer slik som TNFa, noen andre aktivatorer, slik som ioniserende stråling ¹⁰ Elicit endrer that er ikke lett oppdages innen in vitro eksperimentelle tidsrammer av disse svært strenge systemer. Selv om slike små endringer av endotelial celle klebrighet er lett tapt eller avvist in vitro, er det ikke nødvendigvis godartet in vivo, hvor slike små endringer innenfor en levetid, som er karakteristisk for kronisk betennelse, kan utøve meget betydelige resultater. Derav en robust, men likevel følsom og spesifikk metode for å detektere og måle endotelcelletype klebeevnen er nødvendig.

Her rapporterer vi en metode for å måle klebeevnen av endotelceller direkte. Denne metoden ikke er avhengig av måling av fluorescens som en indirekte surrogat indikator på endotelceller klebrighet. Det avslører om endringer i klebrighet skyldes uniform endring på tvers av alle celler eller begrenset til en sub-populasjon. Videre gir det co-farging av endotelceller med markører som senescens-assosiert beta-galaktosidase, celleviabilitet Marker, Calcien AM og antistoffer mot celleoverflate og intracellulære proteiner, slik at foreningen av de enkelte klebe endotelceller til visse celle tilstander eller ekspresjonen av spesifikke proteiner.

Protocol

1. Utarbeidelse av dekkglass Steriliser mm diameter 12 runde dekkglass ved å dyppe dem i 70% etanol i minst 10 minutter med leilighetsvis omrøring for å sikre total eksponering av alle dekk til etanol. Hell dekkglass og etanol i en steril cellekulturskål (enten 6 cm eller 10 cm diameter). Med et par sterile fin 5B tang, plukke opp og plassere hver enkelt glass dekkglass i en brønn av en 24 godt klynge plate. Vær nøye med å sikre at Dekk ikke berører sidene av godt og er omtrent i midten av brønnen. La un dekket 24 godt cluster plate med dekkglass til tørk i flyten kabinettet. Dette tar ca 10 min I løpet av denne perioden, fremstille beleggblandingen ved fortynning av 10 mg / ml humant fibronektin i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) til 0,1 mg / ml. Når objektglassene er tørre, pipettes 100 ul av beleggløsningen på hvert glass coverslip så løsningen kun dekker glasset uten å samle seg rundt utsiden av brønnen. Plasser dekket 24 også klynge plate i en cellekulturinkubator i minst en time. Like før bruk, fjerner beleggløsningen. Det samme beleggsløsning kan overføres til et sterilt rør og brukt opp til tre ganger uten synlig tap av effekt. 2. Utarbeidelse av endotelcelle med ett lag Kultur humane koronare arterie endotelceller (EC) i medium ved 37 ° C og 5% karbondioksid. Aspirer av kultur media og skyll EC monolaget med 10 ml HBSS Aspirer off HBSS og tilsett 2 ml 0,5% Trypsin, 0,2% EDTA løsning. Inkuber ved romtemperatur i omtrent 5 min. Når EC kan forskyves ved et trykk på siden av kolben, tilsett 5 ml soyabønnetrypsininhibitor og med pipette sprute overflaten av kolben for å ytterligere løsne cellene. Overfør cellene til en 15 ml tube og sentrifuger røretved 200 xg i 5 min. Aspirer av supernatanten og resuspender pelleten i EC 5 ml media. Tell cellene med et hemocytometer og justere cellekonsentrasjonen til 50000 EC per ml av EC media. Dispenser 1 ml av cellesuspensjonen i hver brønn på 24-brønners plate inneholdende belagte dekkglass. Inkuber cellene O / N i cellekulturinkubator ved 37 ° C pluss 5% karbondioksid. Cellene er klare til bruk i eksperimenter når et konfluent monolag dannes i løpet av 3 dager. 3. Fremstilling av monocytter Overfør HL-60-celler som er dyrket i RPMI supplert med 10% føtalt kalveserum, som suspensjonskultur, i et 15 ml rør. Sentrifuger cellene ved 200 xg i 5 min. Fjern supernatanten og resuspender cellene i 5 ml medium og justere cellekonsentrasjonen med media til 2 millioner celler / ml. Hvis fluorescens merking av HL-60 er ønskelig, resuspender cellene i RPMI uten serum og PRoceed som beskrevet i kapittel 4. Tilsett 0,5 ml av HL-60 cellesuspensjon til hver brønn på 24-brønners plate inneholdende gruppen EC monolaget og Inkuber platen i en cellekulturinkubator ved 37 ° C og 5% karbondioksyd i en valgt fast tidsrom på mellom 1 og 3 hr. Liten forskjell observeres mellom en time og tre timer tids punkt, hvor binde metning er oppnådd. Forbered celle vask / høsting: Fyll en 120 ml tube med 100 ml HBSS. Dispenser 1 ml formalin i hver brønn av en ny 24-brønners plate. Etter inkubasjonstiden, bruke et par skarpe tang og plukke opp glass dekkglass fra brønnen og hold dekk vertikale og bearbeid kanten av dekkglass på et stykke vev på benken i 3 sek, tar seg ikke å berøre celle dekket overflaten av dekkglass med vevet. Holder dekk fast med en pinsett, dunk dekk inn og ut av de HBSS fem ganger. Etter den femte dunki HBSS, DAB kanten av dekkglass på vevet i 3 sek. Gjenta dunking og dabbing prosedyrene beskrevet i 3.6 og 3.7, slik at totalt tre sett med fem dunks etterfulgt av en skvett. Overfør dekkglass i en brønn inneholdende 10% formalin for å fiksere cellene ved RT. Dekkglass er klar for opptelling, for langtidslagring eller for å bli utsatt for andre prosedyrer som er beskrevet nedenfor. 4. Merking av HL-60 celler med Cell Tracker (valgfritt) Teller og overføre passende mengde av HL-60-celler (f.eks 10 millioner) til et 15 ml sentrifugerør. Sentrifuger HL-60-celler ved 200 xg i 5 min. Fjern supernatant. Resuspender cellepelleten i Cell Tracker i RPMI-medium uten serum i en konsentrasjon på 1 million celler / ml. Inkuber cellene i cellekultur-inkubator i 1 time. Sentrifuger cellene ved 200 xg for 5 min og kast supernatanten. Resuspender cellepelleten i medium til en konsentrasjon på 2 millioner cells / ml. Tilsett 0,5 ml Cell Tracker-merkede HL-60 i hver brønn inneholdende endotelceller dyrket på dekkglass. Fortsett på 3.3. 5. Enumeration av selvklebende endotelceller Mount Dekk på objektglass med DAPI mot flekken for å identifisere individuelle celler. Ved hjelp av en invertert mikroskop med en 4x eller 10X objektiv, hente bilder av flere felt (for eksempel fem felt) og telle det høyeste antall monocytter som samler på un-bestrålt endotelceller (Dette bør vanligvis være 3-5). Set to ganger dette tallet som terskel av monocytter på en endotelcelle å være at defineres som en klynge. Om nødvendig kan et annet kriterium skal brukes for å definere en klynge avhengig av naturen av forsøket. Tell antall klynger og antallet av endoteliale celler i felten. Dividere førstnevnte med den sistnevnte for å oppnå den prosentandel av klebe endotelceller. Scoremange felt for å få et gjennomsnitt og standardavvik for de teller. 6. kontra med Antistoffer Etter adhesjonsassayet og cellene på dekkglass er blitt fiksert i 10% formalin i 15 min ved RT, med forbehold Dekkglass til immunfluorescens ved å bruke standard prosedyre 10 og antistoffer valg. Legge til og fjerne de ulike løsningene svært forsiktig for å unngå å flytte monocytter som er knyttet til endotelceller. 7. kontra for Senescence-assosiert Beta-galaktosidase aktivitet Etter adhesjonsassayet og cellene på dekkglass er blitt fiksert i formalin i 15 minutter og beis for begynnende alderdom-assosiert beta-galaktosidase-aktivitet som beskrevet i instruksjonene som følger fargingssettet. Legge til og fjerne de ulike løsningene svært forsiktig for å unngå å flytte monocytter som er knyttet til endotelceller.

Representative Results

This method allows the detection of individual adhesive endothelial cells within a population. For example, while a monolayer of un-irradiated endothelial cells retained a few sporadic HL-60 monocytes following incubation and washing, endothelial monolayer at 7 days post-10Gy irradiation prior to incubation with monocytes were bound by monocytes in clusters around individual endothelial cells (Figure 1). Although this phenomenon is readily observable under phase contrast microscopy, fluorescence microscopy reveals an even clearer image of the monocyte clusters. After performing the described adhesion assay, it is possible to proceed to staining the cells for membrane, cytoplasmic or nuclear (Figure 2) proteins using appropriate antibodies with standard immunofluorescence methods. Furthermore, enzyme-based assay such as senescence-associated beta-galactosidase (Figure 3) can also be performed. Since each monocyte cluster corresponds to an individual endothelial cell, enumeration of the clusters will reveal the actual number of adhesive endothelial cells within the monolayer (Figure 4), and hence the percentage of adhesive endothelial cells within the population (Table 1, Figure 6). This is the only method to date that allows such quantification of endothelial cell adhesiveness. It is noteworthy that the endothelial cells used in the experiments here are contact-inhibited and do not increase in number after achieving confluence. This eliminates the potential complexity posed by increased endothelial cell number at later time points. If desired, monocytes attached to endothelial monolayers can be dislodged by 0.5% trypsin-0.2% EDTA solution (instead of fixation in 3.9) and their fluorescence measured using a plate reader, as is the case in contemporary methods (Figure 5). Figure 1. Adhesion of monocytes on monolayer of endothelial cells. On un-irradiated endothelial cells, monocytes adhered as individual cells in a sporadic and random manner (left panels) and in clusters on individual endothelial cells of the 7 days post-10 Gy irradiated monolayer (right panels). Lower panels are fluorescence images of the top panels, confirming that the small and bright spherical cells visible under phase contrast are indeed monocytes that were pre-labeled with Cell-Tracker Green. Some of the monocyte clusters are indicated by white arrows. Images were taken using a 10X objective. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 2. Staining of endothelial cells for proteins post-adhesion assay. After performing the described adhesion assay, cells on the glass coverslips were subjected to immunofluorescence for the detection of (A) membrane protein (CD44), b) cytoplasmic protein (Tubulin) or c) nuclear protein (γ-H2AX). Left panels of (A) and (B) (seen with 20X objective) show monocytes pre-labelled with Cell Tracker Green and the similar image on the right panels reveal CD44 and microtubules (red) and DAPI-stained nuclei (blue). White arrows in (C) point to irradiated endothelial cell nuclei that were stained with antibodies against γ-H2AX. Monocyte nuclei which are stained a brighter blue by DAPI are easily distinguished from the oval shaped nuclei of the endothelial cells. Images were taken with 20X objective. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 3. Senescence-associated beta-galactosidase staining of endothelial cells. After adhesion assay, cells on coverslips were subjected to staining for senescence-associated beta-galactosidase which causes lysosomes of senescent cells to turn blue, as is evident in the endothelial cell that is selectively bound by numerous monocytes, which are easily identified due to their small size and spherical shape. Image seen through 20X objective. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 4. Enumeration of monocyte clusters on individual endothelial cells. After adhesion assay, images of the cells were taken from several different positions and monocyte clusters identified and circled (in green). A cluster was defined as an agglomeration of 10 or more monocytes on an endothelial cell. The number of monocyte clusters and number of 12 days post-irradiated endothelial cells (Dotted in red) in the image were counted and percentage of adherent endothelial cells calculated as shown in Table 1. Image taken through 10X objective. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 5. Quantification of fluorescence of adherent monocytes. Following adhesion assay, cells on glass coverslips were trypsinised and the fluorescence of monocytes pre-labelled with CellTracker Green was measured, using a fluorescence plate reader, as an indirect indicator of the adhesiveness of the endothelial monolayer. Results from such measurements at stated days post-irradiation were obtained and platted on the graph above. Figure 6. Representation of adhesion assay scores from Table 1. Adhesive endothelial cells in five different locations on three glass coverslips were scored as described in Figure 4 and the results tabulated above demonstrating that 12 days after 10 Gy irradiation, 8 to 10 percent of irradiated endothelial cells became adhesive. Percentage of adhesive endothelial cells Disc 1 Disc 2 Disc 3 Field 1 8.65 8.29 8.21 Field 2 10.44 7.27 7.21 Field 3 9.63 9.05 8.33 Field 4 11.11 7.09 8.41 Field 5 10.55 9.4 11.61 Average 10.07 8.22 8.75 Table 1. Adhesion assay scores. Adhesive endothelial cells in five different locations on three glass coverslips were scored as described in Figure 4 and the results tabulated above demonstrating that 12 days after 10 Gy irradiation, 8 to 10 percent of irradiated endothelial cells became adhesive.

Discussion

The monocyte adhesion assay described above was used successfully in experiments designed to study the biological effects of ionizing radiation on endothelial monolayers¹⁰. Although this is not the only method available to assess the adhesiveness of an endothelial monolayer, it is the only method that allows the quantification of the proportion or percentage of endothelial cells within a monolayer that is adhesive. This is an important distinction as a global quantitative change in adhesion of monocytes, as measured by other methods can be attributed either to a general rise in adhesiveness of all cells of the endothelial monolayer or to the increase adhesiveness of a sub-population of endothelial cells within the monolayer, as shown in the example above. The value of having this information is exemplified by the fact that the ability to quantify the percentage of endothelial cells that exhibited enhanced adhesiveness after irradiation led to the inescapable conclusion that this effect is not due to genetic mutation of a particular gene as the percentage of cells that were adhesive were greatly above (over 1,000 times more) that which would be expected from random mutation of a gene by X-radiation at that dose.

The factor that allows good reproducibility of the results is the washing regime. As the washing procedure involves the immersion of the glass coverslip into the wash buffer followed by dabbing on a tissue, variability in the buffer turbulence which inevitably arises from the old method of pipetting of the wash buffer into a well is avoided. Indeed it was the observation of excessive variability between replicates obtained using the pipetting method that compelled us to devise a washing procedure that removed the variability element from the washing step.

Admittedly, the limitations of this assay lie in the need to carry out manual count of monocyte clusters, which do not allow it to be adapted for high throughput analyses. Secondly, the decision on how many monocytes constitute a cluster has to be determined semi-arbitrarily and the level may be set too high and result in the exclusion of some genuine clusters. The lack of shear force in this method can also be viewed as a limitation in experiments in which grossly enhanced adhesiveness of endothelial cells is induced (e.g., +TNFα). In other situations however, the lack of shear force is an advantage as it allows the detection of less exaggerated augmentation of adhesiveness. Modest increase in monocyte adhesiveness can be particularly important and relevant. In vivo, monocytes would not (in a typical experimental time) be expected to attach in great numbers to endothelial cells with modest increase in adhesiveness, largely due to shear force. In time however, some monocytes probably would, and this is more likely to represent the environment of chronic inflammation. As such, the absence of shear force can be an advantage as it provides the opportunity for small increases in endothelial cell adhesiveness to be revealed in experimental time frames which are typically short and possibly too fleeting to allow modest increase in adhesiveness to be observed under shear stress.

The ability to subject the cells after this assay to other analyses such as senescence assay and immunofluorescence staining increases the usefulness of this method as it allows the association of adhesiveness of specific endothelial cells to particular cellular proteins or cellular states as demonstrated above, a feature that is not available with the older adhesion assays.

This method has been used with est2-immortalised human coronary endothelial cells and similar results were also obtained with primary human coronary endothelial cells¹⁰, demonstrating that it is not specific to just a particular cell line. Also, the adoption of this method of assaying adhesiveness of endothelial cells do not preclude subjecting the same cells to the standard adhesion assay that measures fluorescence of labeled immunocytes. Together, this report demonstrates that this method is versatile, inclusive and provides much more information than the standard adhesion assay.

Materials

Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)	Sigma	H6648
Glass coverslips Round 12mm Diameter	Menzel-Glaser	CB00120RA1
24-well cluster plate	Costar	3526
Meso-Endo Cell media	Cell Applications	212-500
Trypsin-EDTA	Sigma	T4174
Soybean trypsin inhibitor	Life Technologies	17075-029
Cell Tracker Green	Life Technologies	C7025
RPMI	Sigma	R8758
Foetal Calf Serum	Life Technologies	10500064
Beta glasctosidase Assay kit	CellSignaling	9860
Fibronectin	Sigma	F0895